劉明月，胡 陽，毛敏杰，康鈺晨，李虎丹，李春林，常巧呈*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.浙江農(nóng)林大學動物科技學院)

巴貝斯蟲是屬于頂復門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoaside)、梨形蟲目(Piroplasmorida)、巴貝斯蟲科(Babesiidae)、巴貝斯蟲屬(Babesia.spp)的一類單細胞寄生蟲。最初，巴貝斯蟲的鑒定主要是通過紅細胞內(nèi)蟲體形態(tài)來進行鑒別，隨著聚合酶鏈式反應(PCR)等分子技術的出現(xiàn)，許多新的蟲種和基因型相繼被發(fā)現(xiàn)[1]。犬巴貝斯蟲病是一種嚴重危害犬健康的重要蜱傳性血液原蟲病，引起該病的病原體有犬巴貝斯蟲(Babesiacanis)、吉氏巴貝斯蟲和韋氏巴貝斯蟲(BabesiaWebster)三種，在我國主要為前兩種[2]。其病原常寄生于犬的紅細胞內(nèi)，蟲體常為圓形、卵圓形和梨籽型，有時在紅細胞內(nèi)可發(fā)現(xiàn)2個以上蟲體[3-4]?？梢鸢l(fā)熱、貧血、黃疸等非特異性臨床癥狀，嚴重感染甚至會導致死亡。犬巴貝斯蟲病主要通過蜱傳播，呈現(xiàn)出一定地方性和季節(jié)流行性，尤其在有蜱滋生的地區(qū)，春、夏、秋、冬季均可發(fā)病[5-6]。隨著城市養(yǎng)犬數(shù)量增多，本病的發(fā)病率也越來越高，危害十分嚴重。

目前，用于該病診斷的免疫方法主要有補體結合反應、間接免疫熒光試驗、間接血凝試驗、被動血凝抑制試驗、毛細管凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫試驗和標記抗補體熒光抗體試驗等[7]。其中間接免疫熒光試驗和補體結合反應較為敏感，但在臨床應用中發(fā)現(xiàn)有時會出現(xiàn)使用不同的免疫學方法檢測結果差異較大的情況，并且不能鑒定和區(qū)別蟲種。直接法是通過染色鏡檢的方式直接在動物血液中觀察到蟲體，該方法對染蟲率較高的急性感染病例檢出率較高，而對隱性帶蟲感染病例檢出率較低，而PCR技術是對該病診斷、鑒定、區(qū)別蟲種較為敏感的技術。因此，本試驗在臨床檢查，生理生化檢查及血涂片鏡檢時發(fā)現(xiàn)紅細胞中可見梨籽形狀蟲體，初步懷疑是巴貝斯蟲病的基礎上，使用梨形蟲18S rDNA序列的PCR通用引物進行擴增，并對產(chǎn)物測序鑒定，與相關巴貝斯蟲序列比對分析并構建進化樹，對蟲種進行鑒定分析，探討蟲體間的遺傳進化關系，從分子水平上對病原進行鑒定和分類。

1 材料與方法

1.1基本情況 北京市某寵物醫(yī)院于2020年6月1日接診一例疑似吉氏巴貝斯蟲感染病犬，病犬為比熊公犬，2歲4個月，體重6.2 kg。

1.2血常規(guī)檢查 采取病犬前肢外側(cè)隱靜脈血少量，利用血液分析儀對病犬白細胞、紅細胞和血小板計數(shù)，以及血紅蛋白水平等系列參數(shù)進行分析。

1.3生化檢查 采取病犬前肢外側(cè)隱靜脈血少量，放于離心管內(nèi)，置高速離心機離心，血清備測。使用全自動生化分析儀對病犬血清進行各項常規(guī)生化指標的檢驗。

1.4血涂片檢查 采集動物耳緣靜脈或前肢靜脈的血液，滴一滴于干凈的載玻片上，用潔凈蓋玻片口呈30°- 40°角，快速且用力地推開血滴，使其成薄血膜，待其自然干燥后滴適量甲醇完全覆蓋血膜涂片，使其固定，待甲醇自然揮發(fā)晾干后用DIFF QUIK A染液染色10 min，用流動的蒸餾水輕柔地沖洗玻片，注意不要直接沖洗血膜，晾干后在油鏡下觀察。

1.5分子生物學檢查

1.5.1DNA提取 采取動物新鮮血液，按照TIANamp說明書提取DNA，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.5.2PCR擴增 按照常規(guī)PCR擴增方法擴增18S rDNA部分序列。應用引物PIRO OF(5′-GCC AGT CAT ATG CTT GTG TTA-3′)，PIRO 6R(5′-CTC CTT CCT YTA AGT GAT AAG GTT CAC-3′)[8]，PCR擴增體系(總體積為25 μL)：上下游引物各0.5 μL；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ 12.5 μL；模板1 μL；ddH2O 10.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s；共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.3序列測定及進化分析 將PCR擴增產(chǎn)物送至庫美生物科技有限公司測序，測序結果用DNASTAR 5.0軟件分析，與GenBank上不同地區(qū)具有代表性的巴貝斯蟲屬的18S rDNA序列進行比較分析。用Clustal X 1.83軟件和MEGA 6.0軟件對本試驗中及GenBank上相關犬巴貝斯蟲18S rDNA序列比對分析，并用Maximum-Likelihood法共同構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果與分析

2.1臨床及實驗室檢查 臨床檢查病犬精神沉郁，體弱消瘦，不愿活動，進食減少，可視黏膜蒼白，牙齦蒼白。血常規(guī)檢查病犬白細胞和中性粒細胞絕對值數(shù)量增加，提示有細菌感染、過敏反應或者寄生蟲感染。紅細胞、血紅蛋白數(shù)量降低，提示病犬處于貧血狀態(tài)。血小板數(shù)量和紅細胞壓積偏低，推斷與貧血有關(表1)。

表1 血常規(guī)檢查異常指標

生化檢查顯示病犬總蛋白和球蛋白數(shù)量增加，總膽紅素升高，表明機體有不同程度的溶血現(xiàn)象(表2)。

表2 生化檢查異常指標

2.2血涂片檢查 提取病犬血液，涂片并用DIFF QUIK A染色后，可以在油鏡(1000×)下觀察到紅細胞內(nèi)有染成藍紫色的梨籽形蟲體(圖1)，確認犬巴貝斯蟲感染，但具體蟲種仍需其他方法進一步鑒定。

圖1 患犬血涂片(箭頭所指為蟲體1000×)

2.3分子生物學檢查

2.3.1PCR擴增結果 應用引物PIRO OF、PIRO 6R，利用PCR方法擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴增出大小約為1560 bp的DNA片段，得到了與陽性對照大小相似的條帶(圖 2)。

圖2 病犬18 S rDNA PCR電泳結果圖

2.3.2序列測定及進化分析 測序結果得到1條長度為1560 bp的核苷酸序列，將該序列提交GenBank(NCBI)其登錄號為MW276038.1并與GenBank登錄的相關巴貝斯蟲序列進行對比分析，發(fā)現(xiàn)患病犬樣本中獲得的巴貝斯蟲18S rDNA序列與Babesiagibsoni(MN928823.1)相似度為99.94%。以雙芽巴貝斯蟲(KM046917.1)為外群，與GenBank中不同國家和地區(qū)犬可感染的巴貝斯蟲18S基因序列運用MEGA6.0軟件采用ML法構建進化樹，結果顯示為犬可感染的巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲兩個大的分支，該病犬基因序列與吉氏巴貝斯蟲位于同一分支中，其中與來自中國西安株(MN928823.1)和日韓株(AB478330.1)親緣關系較近[9](圖3)。從分子水平上證實了本實驗中擴增的蟲體為吉氏巴貝斯蟲。

圖3 基于18 S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

巴貝斯蟲病主要通過蜱傳播，在美國、澳大利亞、意大利、德國、韓國等國家均報道過人及動物感染的病例，我國近年關于犬巴貝斯蟲感染的報道也在增加，在臺灣、武漢、陜西、南京、北京、廣東等地區(qū)均有感染病例的報道[10]。呈現(xiàn)出一定地方性和季節(jié)流行性尤其在有蜱滋生的地區(qū)，春、夏、秋、冬季均可發(fā)病。隨著城市養(yǎng)犬數(shù)量增多，本病的發(fā)病率也越來越高，危害十分嚴重，要做好防蜱滅蜱工作。在流行區(qū)對于健康犬，可用貝尼爾進行預防注射，在易感染季節(jié)盡量不要帶犬上山或到草坪處玩，若去蜱易存在的地方應事先給犬佩戴殺蜱項圈或涂福來恩等藥物進行預防。此外，還要定期對健康犬進行藥浴驅(qū)蟲?，F(xiàn)在國外一些地區(qū)已經(jīng)廣泛應用巴貝斯蟲病弱毒疫苗或分泌性抗原疫苗進行預防接種[11-12]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，病犬發(fā)病時通常表現(xiàn)為貧血、乏力、黃疸，紅細胞、血紅蛋白數(shù)量、血小板數(shù)量及紅細胞壓積降低，總蛋白和球蛋白數(shù)量增加，總膽紅素升高。臨床通常采用血涂片檢查的方法，但該方法對染蟲率較高的急性感染病例檢出率較高，而對隱性帶蟲感染病例檢出率較低，而PCR技術是對該病診斷、鑒定、區(qū)別蟲種較為敏感的技術[7]。因此，本試驗在臨床檢查，生理生化檢查后，血涂片鏡檢時發(fā)現(xiàn)紅細胞中可見梨籽形狀蟲體，初步懷疑是巴貝斯蟲病的基礎上，使用真核生物18S rDNA基因的PCR通用引物進行擴增，測序得到序列長度為1560 bp與GenBank登錄的Babesiagibsoni(MN928823.1)同源性為99.94%。并以雙芽巴貝斯蟲(KM046917.1)為外群，用GenBank中不同國家和地區(qū)的巴貝斯蟲18S rDNA序列構建進化樹，通過比對發(fā)現(xiàn)其與中國西安株(MN928823.1)親緣關系較近，與西班牙、美國株相對較遠。本研究經(jīng)臨床檢查、生理生化檢查和血涂片檢查確定該犬患有巴貝斯蟲病，經(jīng)分子生物學方法最終確定感染的巴貝斯蟲病原為吉氏巴貝斯蟲(B.gibsoni)。