胡煒昊，阿依恒·曲庫爾汗

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科,烏魯木齊 830054）

中耳膽脂瘤是耳鼻喉科的一種常見疾病，其上皮細(xì)胞增生活躍，具有類似腫瘤細(xì)胞過度增殖的特性，包括細(xì)胞增殖、遷移、分化和侵襲[1]。中耳膽脂瘤形成的各種學(xué)說都與角質(zhì)形成細(xì)胞有著密切的關(guān)系，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖是造成中耳膽脂瘤擴(kuò)大和誘導(dǎo)骨質(zhì)破壞的主要原因，涉及多種細(xì)胞因子和分子作用通路[2-4]。其中膜聯(lián)蛋白A2（AnxA2）在膽脂瘤的角質(zhì)形成細(xì)胞核中表達(dá)，且AnxA2 在角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖中可能發(fā)揮了重要生理作用[5]，提示AnxA2 可能是中耳膽脂瘤發(fā)病過程中侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組分。

紫草是我國一種常用的傳統(tǒng)中藥，屬于紫草科紫草屬，在我國多個(gè)地區(qū)都有分布，尤其以新疆紫草或內(nèi)蒙古紫草較為多見。目前研究發(fā)現(xiàn)紫草中含有多種重要的生物活性成分，紫草素就是其中一種具有特殊功效的生物活性成分，其作為從紫草中提取出的一種萘醌類化合物，對(duì)其藥理作用及臨床應(yīng)用的研究近年來逐漸深入[6]。紫草素的藥理作用極為廣泛，包括抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗病毒[9]、抗氧化損傷[10]等重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過用不同濃度（0、1、5、10 μmol/mL）的紫草素干預(yù)正常生長的HaCat細(xì)胞，觀察研究紫草素對(duì)HaCat 細(xì)胞生長狀態(tài)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期以及細(xì)胞增殖的影響，并采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qP?CR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-blot）技術(shù)分別研究不同濃度紫草素干預(yù)對(duì)HaCat 細(xì)胞中AnxA2 的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，探討紫草素對(duì)中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖的潛在抑制作用，為紫草素治療中耳膽脂瘤的相關(guān)分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源人永生化角質(zhì)細(xì)胞株（HaCat 細(xì)胞）購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫（編號(hào)：KCB200442YJ）。

1.2 主要試劑與儀器紫草素、總蛋白提取試劑盒均購自上海索萊寶生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液PBS均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；南美胎牛血清FBS、胰酶均購自美國Gibco公司；雙抗購自美國Hyclone 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自德國Biofroxx 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國賽默飛公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購自日本TAKA?LA 公司；兔抗人單克隆抗體AnxA2、山羊抗兔IgG 抗體均購自北京博奧森公司；RT-PCR 所用的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。CO2培養(yǎng)箱（HERA cell 240）、酶標(biāo)儀、熒光定量PCR 儀（美國賽默飛公司），倒置熒光顯微鏡（IX71）（中國奧林巴斯公司），低速離心機(jī)（TDL-5A）（上海安亭科學(xué)儀器廠），低溫冷凍型離心機(jī)（Centrifuge 5415 R）（德國艾本德公司），電泳儀（上海索萊寶生物科技有限公司），蛋白凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 紫草素濃度配制 將紫草素用DMSO（濃度<0.1%）溶解，配置成母液濃度為10 μmol/mL 的溶液，于-80℃分裝保存，臨用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度（1、5、10 μmol/mL）供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HaCat 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清和5%雙抗的DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)HaCat細(xì)胞貼滿壁或細(xì)胞數(shù)量占80%以上，則可進(jìn)行細(xì)胞傳代。每2～3天傳代1次，取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待HaCat 細(xì)胞貼壁后分別加入1、5、10 μmol/mL 濃度的紫草素溶液，并將不加紫草素組（0 μmol/mL）設(shè)為正常對(duì)照組。將分好組的細(xì)胞置于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài) 將處理好的各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h，期間每隔6 h 移置顯微鏡下觀察每組細(xì)胞的大小、形態(tài)變化、貼壁情況以及細(xì)胞密度等，觀察的同時(shí)拍攝照片。

1.3.4 劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 先用marker 筆標(biāo)記6孔板，用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，分別制備細(xì)胞懸液。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，鋪6 孔板，密度使其控制在次日能長滿。用10 μL 槍頭做劃痕，劃痕方向與marker 筆標(biāo)記線垂直。分別向各組加入2 mL 無菌PBS 輕輕沖洗培養(yǎng)板，重復(fù)3 次。細(xì)胞換液，加入無血清的培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后于顯微鏡下進(jìn)行拍照，觀察各組細(xì)胞遷移情況。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，用0.25%的胰酶消化收集各組細(xì)胞，分別制備細(xì)胞懸液，1 500 r/min，離心5 min，吸棄上清，各加1 mL 無菌PBS 重懸細(xì)胞沉淀，重復(fù)兩次。分別加入2 mL 預(yù)冷的70% 濃度的酒精，置于-20℃冰箱固定過夜。1 500 r/min，離心5 min。各加1 mL無菌PBS，1 500 r/min，離心5 min，各加500 μL 的無菌PBS 重懸細(xì)胞。加入RNA 酶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，1 500 r/min，離心5 min，各加500 μL 的無菌PBS、重懸細(xì)胞。加入染色劑碘化丙啶（PI）（工作濃度50 μg/mL）進(jìn)行染色，避光操作，室溫孵育30 min，細(xì)胞過篩，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。

1.3.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖 在顯微鏡鏡下對(duì)培養(yǎng)的HaCat 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，鏡下觀察約2×106個(gè)/mL，將細(xì)胞接種到96 孔板上，每個(gè)孔的細(xì)胞約6×103個(gè)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細(xì)胞貼壁后移除培養(yǎng)基，每孔加200 μL 含不同濃度（1、5、10μmol/mL）紫草素的完全培養(yǎng)基，設(shè)0 μmol/mL 為正常對(duì)照組，每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加20 μL 的水溶性四唑鹽（CCK-8 試劑），于CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，置于酶標(biāo)儀中，記錄450 nm 波長的吸光度。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.7 RT-qPCR 檢測AnxA2 基因mRNA 的表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞的總RNA,測定RNA 的純度和濃度，并將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。從GeneCards中獲得AnxA2 的mRNA 序列，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物，詳見表1。

表1 RT-qPCR引物

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min；4℃終止反應(yīng)。根據(jù)TAKALA 公司試劑盒說明書將獲得的cDNA 模板配好反應(yīng)體系，然后在熒光定量PCR 反應(yīng)儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃，30 s（預(yù)變性，1 個(gè)循環(huán)）；95℃，5 s 和60℃，30 s（PCR 反應(yīng)，40 個(gè)循環(huán)）。相對(duì)定量方法用2-△△Ct法，結(jié)果用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖形分析。

1.3.8 Western-blot 檢測AnxA2 蛋白的表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，用蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）測定蛋白的濃度進(jìn)行蛋白定量，于100℃煮沸10 min，變性，冷卻。上樣20 μg 蛋白樣品，進(jìn)行10% 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，用含5% 脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液（PBST）封閉1 h，TBST 洗膜3次，分別加入對(duì)應(yīng)I 抗于4℃搖床孵育過夜。次日用等滲鹽緩沖溶液（TBST）洗膜3 次，加入對(duì)應(yīng)Ⅱ抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗膜3 次。用蛋白成像系統(tǒng)采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示，組間比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)制圖采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞生長狀態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察，鏡下可見對(duì)照組的HaCat細(xì)胞呈貼壁生長，排列緊密，細(xì)胞輪廓清楚可見，呈多角形伸展。而加入紫草素干預(yù)后，HaCat 細(xì)胞失去原有的細(xì)胞形態(tài)，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變圓或呈不規(guī)則形狀，細(xì)胞間的接觸變松，增殖減慢，細(xì)胞貼壁性降低，部分細(xì)胞裂解成細(xì)胞碎片或脫落呈漂浮狀態(tài)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，用1、5、10 μmol/mL 濃度的紫草素干預(yù)Ha?Cat細(xì)胞后，隨著紫草素濃度的增加，貼壁生長的細(xì)胞密度越低，見圖1。

圖1 不同濃度紫草素處理24 h的HaCat細(xì)胞生長狀態(tài)

2.2 紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組HaCat 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，正常對(duì)照組細(xì)胞幾乎長滿培養(yǎng)板，而1、5、10 μmol/mL 組細(xì)胞隨紫草素濃度的增加劃痕越來越寬，表明細(xì)胞遷移的速率隨紫草素濃度的增加而降低。見圖2。

圖2 紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞遷移的影響

2.3 紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀分析檢測培養(yǎng)24 h后的各組HaCat細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，隨著紫草素濃度的增加，處于G1期HaCat細(xì)胞的比例呈劑量依賴性升高，處于S期細(xì)胞的比例呈劑量依賴性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明紫草素能夠阻滯HaCat 細(xì)胞的生長，使細(xì)胞阻滯在G1期，見圖3。

圖3 紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞周期的影響（n=3）

2.4 紫草素對(duì)HaCat 細(xì)胞增殖的影響用CCK-8法檢測不同濃度的紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞增殖的影響，將所測得450 nm 處的吸光度數(shù)據(jù)用±s表示，結(jié)果顯示5 μmol/mL 組和10 μmol/mL 組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而1 μmol/mL 組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 CCK-8法檢測不同濃度紫草素干預(yù)下HaCat細(xì)胞在450 nm波長的吸光度

2.5 紫草素對(duì)HaCat 細(xì)胞AnxA2 mRNA 表達(dá)的影響RT-qPCR 研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著紫草素濃度的增加，AnxA2的mRNA 表達(dá)呈劑量依賴性的降低（P<0.05），除1 μmol/mL 組和5 μmol/mL 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表3。

表3 RT-qPCR檢測不同濃度紫草素干預(yù)下HaCat細(xì)胞AnxA2的mRNA表達(dá)

圖4 紫草素對(duì)HaCat細(xì)胞AnxA2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞具有高度的增殖活性，可侵蝕聽小骨和顳骨并破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聽力喪失、面癱甚至腦膿腫等更致命的顱內(nèi)外并發(fā)癥[11]，其危害性不容小視。目前尚無有效的藥物治療，主要依靠手術(shù)方式去除病灶、改善聽力和防治并發(fā)癥[12]。近年來，有學(xué)者對(duì)膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，主要集中在上皮細(xì)胞過度增殖、炎癥介質(zhì)和骨質(zhì)破壞吸收等方面，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確[13-15]。紫草素是從紫草中提取的一種萘醌類化合物，多項(xiàng)研究表明紫草素及其衍生物具有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且作用機(jī)制呈現(xiàn)多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)[16-19]。

膜聯(lián)蛋白A2是一種依賴鈣離子介導(dǎo)的磷脂結(jié)合特性的蛋白質(zhì)，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，包括胞吞和胞吐、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和離子通道的形成等[20]。在中耳膽脂瘤中，膜聯(lián)蛋白A2 在膽脂瘤的基底層和棘層中的細(xì)胞質(zhì)膜和角質(zhì)形成細(xì)胞核中表達(dá)。有研究表明，在人膽脂瘤的發(fā)展過程中，膜聯(lián)蛋白A2在角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖中的可能發(fā)揮了生理作用[5]。也有研究表明，與正常對(duì)照組相比，膽脂瘤中AnxA2 和表皮生長因子受體（EGFR）mRNA 的表達(dá)明顯升高，且AnxA2 和EGFR 的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)[21]，提示AnxA2 可能是中耳膽脂瘤發(fā)病過程中侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組分。

本研究結(jié)果顯示，通過用不同濃度的紫草素對(duì)HaCat 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)紫草素可以影響HaCat 細(xì)胞的生長狀態(tài)、阻滯細(xì)胞周期、降低細(xì)胞遷移速率以及抑制細(xì)胞增殖，且隨著紫草素濃度的增加，細(xì)胞密度越低，處于G1 期的細(xì)胞比例越高，處于S 期的比例越低，細(xì)胞的遷移速率越低，而且紫草素可呈劑量依賴性地抑制HaCat 細(xì)胞的增殖。隨著紫草素濃度的升高，HaCat 細(xì)胞AnxA2 的mRNA 表達(dá)呈劑量依賴性降低，且AnxA2 蛋白表達(dá)量也逐漸降低，提示紫草素對(duì)HaCat 細(xì)胞增殖的抑制作用可能與下調(diào)AnxA2 的表達(dá)有關(guān)。

角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖以及在膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞核中表達(dá)的AnxA2 在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過研究紫草素對(duì)Ha?Cat 細(xì)胞和AnxA2 表達(dá)水平的影響，探討紫草素對(duì)中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖的潛在抑制作用及相關(guān)靶標(biāo)。但本實(shí)驗(yàn)僅就紫草素對(duì)正常的HaCat 細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究，對(duì)于AnxA2 誘導(dǎo)后高增殖狀態(tài)的HaCat 細(xì)胞是否有類似作用，有待進(jìn)一步證實(shí)。

基于目前紫草素在膽脂瘤方面的研究，目前還沒有充足的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明藥物治療可以完全取代手術(shù)治療，所以紫草素的應(yīng)用可考慮作為手術(shù)治療中耳膽脂瘤的一種輔助療法。建議手術(shù)后局部應(yīng)用紫草素制劑，甚至作為生物可吸收凝膠，可能會(huì)顯著減少膽脂瘤的復(fù)發(fā)。但中耳膽脂瘤作為一種耳部疾病，紫草素制劑是否具有耳毒性也是需要慎重考慮的問題?；谀壳暗难芯亢驮O(shè)想，紫草素在治療中耳膽脂瘤方面可能具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。