劉曉明 尼秀媚 劉永光 馬晉芳 林亞君

（濰坊科技學(xué)院 山東壽光 262700）

Kaiser等［1］1968年首次報(bào)道分離自梭菌（Clostridium alginolyticum）的胞外褐藻膠裂解酶，目前，科研工作者在褐藻膠裂解酶的研究領(lǐng)域取得大量成果，例如，藻酸雙脂鈉（PPS）、海立特等海洋藥物的問世極大地鼓舞了科學(xué)工作者向海洋要寶的信心。褐藻膠作為源自褐藻植物細(xì)胞壁的水溶性酸性多糖，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［2］。

海藻肥料作為新一代天然海洋生物肥料，具有多種高活性成分和營(yíng)養(yǎng)元素，有明顯的增產(chǎn)效果和極強(qiáng)的抗逆作用，在環(huán)境保護(hù)、經(jīng)濟(jì)效益方面的表現(xiàn)突出［3］。目前，比較常見的褐藻膠降解糖化方法包括稀酸加熱法、堿降解法、氧化降解法、直接加熱法、輻射法和生物方法［4］。生物方法具有高效、預(yù)處理簡(jiǎn)單和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，是褐藻膠糖化的必 要手段［5-7］。

微生物發(fā)酵除了能產(chǎn)生高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海藻肥外，其產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶酶解產(chǎn)物褐藻寡糖還能抗凝血、降血糖血脂［8-9］、抗腫瘤［10–11］、清除自由基［12］、促進(jìn)腸道雙歧桿菌生長(zhǎng)［13］，具有較高的食用和藥用價(jià)值。因此,篩選和發(fā)現(xiàn)高效的褐藻膠降解菌,對(duì)其褐藻膠裂解酶進(jìn)行研究已逐漸成為微生物應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5-6］。

褐藻膠裂解酶來(lái)源廣泛，例如，海藻類、海洋軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、海洋細(xì)菌、陸生真菌及土壤細(xì)菌等［14］，微生物來(lái)源主要有假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）［15］等。

菌株A78 篩選自腐爛的海帶，能在48 h 內(nèi)高效降解海帶塊，具有較強(qiáng)的褐藻膠降解功能和應(yīng)用潛能。對(duì)菌株A78 的鑒定及其所產(chǎn)褐藻膠裂解酶的特性進(jìn)行研究，為該類微生物資源降解褐藻膠及褐藻生物能源轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

菌株：從海帶中分離純化出的海洋細(xì)菌A78。

試劑：DNS 試劑、褐藻酸鈉（化學(xué)純，國(guó)藥）、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、磷酸高鐵（分析純，國(guó)藥）、2×PCR MasterMix（杭州寶賽）。

培養(yǎng)基：2216E 培養(yǎng)基（添加濃度為0.1 g／L磷酸高鐵）、LB 液體培養(yǎng)基（北京陸橋）。

緩沖液：不同pH 值的緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH=4～8、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH=9～10。

1.2 引物合成 菌株16S rDNA 序列擴(kuò)增引物選用27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ 和1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司（上海生工）合成。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠酶活性透明圈驗(yàn)證 在2216E 培養(yǎng)基中添加20 g／L 的褐藻酸鈉溶液和0.1 g／L的磷酸鐵溶液，高壓滅菌，冷卻至室溫后，將海洋細(xì)菌A78 接種至2216E 培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5～7 d。加入10%的氯化鈣，靜置30 min，觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

1.3.2 PCR 反應(yīng)與測(cè)序 以27F 和1541R 為引物，以A78 菌株總DNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增得到目的基因。PCR 反應(yīng)體系為40 μL，其中含1 μL 引物27F、1 μL 引物1541R、2 μL DNA 模板、20 μL 2×PCR Master Mix 及16 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1.5 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃3 min。PCR 產(chǎn)物膠回收后送至測(cè)序公司（上海生工）進(jìn)行測(cè)序，序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3 褐藻膠裂解酶活性測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)采用DNS 法（比色法）測(cè)褐藻膠裂解酶的活性［12-13］。

1.3.4 褐藻膠酶最適溫度與最適pH 值的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃共8 個(gè)溫度梯度，pH 值為4、5、6、7、8、9和10 共7 個(gè)梯度，分別使用了磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液進(jìn)行配制。

1.3.5 不同濃度誘導(dǎo)物對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 50 mL LB 培養(yǎng)基中分別加入0.5%、1%、1.5%的褐藻酸鈉和等大的海帶塊，接入相同量的菌液，30℃培養(yǎng)48 h，觀察海帶降解情況并檢測(cè)褐藻膠酶活性判斷誘導(dǎo)物對(duì)菌株A78 產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 海洋細(xì)菌A78 種類鑒定

2.1.1 海洋細(xì)菌A78 產(chǎn)褐藻膠酶確認(rèn) 細(xì)菌A78 在2216E 培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后，菌落呈現(xiàn)圓形，乳白色，菌落較大，表面光滑，邊緣透明。添加10%的氯化鈣，菌落周圍能產(chǎn)生明顯的透明圈，說(shuō)明菌株A78 菌能產(chǎn)生褐藻膠裂解酶。

2.1.2 海洋細(xì)菌A78 的生理生化特征 對(duì)海洋細(xì)菌A78 進(jìn)行23 項(xiàng)理化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果如表1所示。由細(xì)菌A78 生理生化特性可知，海洋細(xì)菌A78 可將蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等作為唯一碳源，卻不能將麥芽糖、山梨醇、某些氨基酸等作為碳源，這與已報(bào)道的交替假單胞菌屬細(xì)菌的生理生化結(jié)果比較相似。

表1 海洋細(xì)菌A78 生理生化特性

2.1.3 海洋細(xì)菌A78 的16S rDNA 序列鑒定 利用引物27F 與1541R 擴(kuò)增菌株A78 部分16S rDNA 序列，得到1 500 bp 左右的PCR 產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.govBlast/）對(duì)比，獲取與其相似度較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，比對(duì)結(jié)果顯示A78 菌株與假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）的相似度達(dá)到99%以上，親緣關(guān)系最近，因此菌株A78 初步鑒定為假交替單胞菌。

2.2 海洋細(xì)菌A78 的褐藻膠裂解酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)將海洋細(xì)菌A78 置于50 mL LB 肉湯培養(yǎng)基中，在LB 肉湯培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1%、1.5%的褐藻酸鈉和海帶。從圖1可觀察到，加入1%褐藻酸鈉的LB 培養(yǎng)基中的2 塊海帶有一塊已經(jīng)完全降解，另一塊也接近降解。在添加0.5%及1.5%褐藻酸鈉的培養(yǎng)基中，海帶只進(jìn)行了初步降解，說(shuō)明1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)下該菌株產(chǎn)生的褐藻膠酶數(shù)量較大，太高或太低濃度的褐藻酸鈉都不利于誘導(dǎo)菌株A78 產(chǎn)酶。

圖1 加入不同濃度褐藻酸鈉誘導(dǎo)海帶塊降解情況

分別在上清液與菌體分離、未分離的情況下檢測(cè)褐藻膠酶活性，結(jié)果1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)下，上清液加菌體褐藻膠酶活最高。單獨(dú)上清液或菌體酶活都比較低，說(shuō)明該菌所產(chǎn)褐藻膠裂解酶在上清液中與菌體上都存在；1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)下酶活最高，說(shuō)明濃度適中的誘導(dǎo)物能明顯提高菌株A78 褐藻膠酶產(chǎn)量。未加誘導(dǎo)物與加入0.5%褐藻酸鈉、1.5%褐藻酸鈉及海帶塊的褐藻膠裂解酶酶活沒有明顯差距，說(shuō)明誘導(dǎo)物對(duì)菌株A78 產(chǎn)酶有重要影響，且濃度是關(guān)鍵因素；具體數(shù)據(jù)見圖2。

圖2 A78 菌株在不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)作用下的褐藻膠裂解酶活性

2.3 不同溫度與pH 值對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響

2.3.1 不同溫度對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響 溫度是影響酶活性的重要因素。本研究設(shè)置了20℃～55℃之間8 個(gè)溫度梯度，研究了菌株A78 所產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活與溫度之間的關(guān)系。通過圖3可推斷，褐藻膠裂解酶的活性在20℃～25℃之間活性接近零，但是在溫度升高至30℃的過程中，酶活快速增長(zhǎng)，30℃時(shí)已達(dá)到酶活的最大值82.6 U／mL；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至40℃，酶活又逐漸降低；當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，酶活有所回升，但依舊較低；當(dāng)溫度升高到55℃時(shí)，酶活接近零。

圖3 不同溫度對(duì)菌株A78 褐藻膠裂解酶活性影響

2.3.2 不同pH 值對(duì)褐藻膠裂解酶活性的影響不同的pH 值對(duì)褐藻膠裂解酶的活性有著很大的影響，過酸或過堿都會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，從而影響酶的活性［16］。設(shè)置pH 值為4～10 之間的7 個(gè)梯度，在30℃培養(yǎng)菌株A78。根據(jù)圖4可得出，當(dāng)pH 值從4 變至5 時(shí)，褐藻膠裂解酶的活性明顯上升，在pH 值為5～5.5 之間活性最高，可達(dá)到70 U／mL左右。當(dāng)pH 值由5 達(dá)到7 時(shí)，褐藻膠裂解酶的活性接近零。說(shuō)明菌株A78 所產(chǎn)的褐藻膠裂解酶適合偏酸的條件下發(fā)揮酶活。

圖4 不同pH 值對(duì)菌株A78 褐藻膠裂解酶活性影響

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌A78 褐藻膠裂解酶活性的影響 在1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)的LB 液體培養(yǎng)基中，每隔4 h 檢測(cè)一次褐藻膠酶活性，通過圖5可得出，在培養(yǎng)4 h 之后，發(fā)酵液中褐藻膠裂解酶的活性大約為75 U／mL；12 h 以內(nèi)酶活基本不變；但是在培養(yǎng)12 h 之后，褐藻膠酶活性急劇下降，至32 h 達(dá)到最低點(diǎn)，褐藻膠裂解酶的活性接近零。32 h 后，酶活又有所升高，在培養(yǎng)52 h 之后，酶活再次降低。

圖5 不同細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響

出現(xiàn)該發(fā)酵過程可能的原因是，菌株A78 在發(fā)酵前期迅速合成褐藻膠裂解酶，酶的初步產(chǎn)量較高。在12 h 以后，大量分泌到上清液中的褐藻膠酶與底物充分作用，消耗巨大，因此，褐藻膠酶活力逐漸降低。在32 h 后，培養(yǎng)基中的褐藻酸鈉被逐漸消耗殆盡，褐藻膠裂解酶的消耗量降低，因此褐藻膠酶活力又有所上升。菌株A78 所產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶是誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵過程中邊產(chǎn)生邊消耗，因此，發(fā)酵過程中酶活波動(dòng)較大。

3 結(jié)論

菌株A78 分離自日本海域的腐爛海帶，褐藻膠酶篩選平板結(jié)果表明菌株A78 具有褐藻膠酶活性。通過生理生化特征及16S rDNA 序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定［15，17］，初步鑒定結(jié)果為假交替單胞菌。

適當(dāng)濃度的誘導(dǎo)物能提高菌株A78 的褐藻膠酶產(chǎn)量，但褐藻膠酶活力與已報(bào)道的菌株相比沒有顯著優(yōu)勢(shì)［16］，而在海帶塊降解實(shí)驗(yàn)中，本菌株能在48 h 內(nèi)將海帶塊降解，優(yōu)勢(shì)明顯。在酶活檢測(cè)過程中，上清液或菌體中均能檢測(cè)到酶活，而上清液+菌體酶活最高，該結(jié)果表明，菌株A78 所產(chǎn)的褐藻膠裂解酶在上清液和菌體表面均有分布，上清液與菌體表面的褐藻膠裂解酶可能是1 種或多種褐藻膠裂解酶，通過協(xié)同作用達(dá)到高效降解褐藻膠的效果。

溫度實(shí)驗(yàn)中，菌株A78 褐藻膠酶活力峰有2個(gè)，其中一個(gè)主峰在30℃左右，另一個(gè)酶活峰出現(xiàn)在45℃左右；pH 值實(shí)驗(yàn)中，酶活力峰有2 個(gè)，其中一個(gè)主峰是在pH=5 左右，另一個(gè)小的酶活峰在pH=9 左右。出現(xiàn)這種結(jié)果可能是該菌含有1個(gè)以上褐藻膠裂解酶基因，而2 個(gè)基因表達(dá)的酶的量與特性有較大區(qū)別，但要清楚的確證，還需要進(jìn)行后續(xù)的菌株A78 褐藻膠裂解酶的分離純化，并進(jìn)行純化酶的特性研究。

本研究初步探究出由海洋細(xì)菌A78 產(chǎn)的褐藻膠裂解酶與底物反應(yīng)的最適pH 值、溫度及細(xì)菌培養(yǎng)的最適時(shí)間，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為30℃、pH 值為5～5.5、培養(yǎng)時(shí)間為4～12 h 時(shí)褐藻膠裂解酶的活性最高。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)A78 細(xì)菌在1%褐藻酸鈉的誘導(dǎo)下才能產(chǎn)出大量的褐藻膠裂解酶，過高或過低的誘導(dǎo)物濃度都不利于該菌產(chǎn)酶。研究結(jié)果對(duì)假交替單胞菌的開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。