馬 艷，黎 蓓，李 盈，程志祥

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)發(fā)生率在惡性腫瘤中位居第四，病死率位居第三，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染是HCC發(fā)生的主要原因[1]。目前HCC首選肝切除術(shù)等手術(shù)治療，但部分晚期患者無(wú)手術(shù)適應(yīng)證，部分早期患者術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率，預(yù)后較差，因此尋找肝癌治療的靶點(diǎn)及預(yù)測(cè)患者預(yù)后的標(biāo)志物對(duì)臨床治療意義重大。HBV感染是HCC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其調(diào)控的相關(guān)基因的變化可能與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。HBVx蛋白(HBx)是HBV開放編碼框編碼的病毒蛋白，可與宿主相關(guān)因子結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生理過(guò)程；另外，HBx也可通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變細(xì)胞的生物學(xué)行為[2-3]。HCC作為一種富供血惡性腫瘤，其發(fā)生及發(fā)展均與血管生成密切相關(guān)，血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可參與脂代謝、細(xì)胞分化、能量平衡、炎癥等過(guò)程；另外，其與血管生成素作用類似，具有調(diào)節(jié)血管生成的作用[4]。目前已有對(duì)HBx、ANGPTL4與HCC的關(guān)系研究，但多數(shù)集中于體外細(xì)胞或血清學(xué)方面[5-6]，組織學(xué)方面的研究較為缺乏，且較少探討其與臨床病理的關(guān)系。本研究以HBV相關(guān)性HCC患者組織標(biāo)本作為研究樣本，分析其與癌旁組織HBx、ANGPTL4表達(dá)的差異及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，旨在為HCC患者的病情評(píng)估、預(yù)后預(yù)測(cè)提供一定指導(dǎo)，也為HCC的靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2014年12月—2017年3月98例HBV相關(guān)性HCC患者經(jīng)手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本為研究對(duì)象。均經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前未接受放化療及其他輔助治療措施，病歷資料完整。98例中男59例，女39例；年齡33～72(56.47±7.82)歲；存在包膜侵犯者39例；臨床分期為Ⅰ期20例，Ⅱ期44例，Ⅲ期22例，Ⅳ期12例；低分化38例，中高分化60例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者41例。另?yè)?0例距腫瘤切緣5 cm以上的癌旁正常肝組織為癌旁組織，其中男33例，女17例；年齡31～70(56.12±7.89)歲。2組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理及石蠟切片制作：新鮮標(biāo)本采用甲醛溶液固定，經(jīng)流水洗滌、梯度乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋制作成石蠟包埋塊；采用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，挑取完好的組織切片進(jìn)行展片、貼片。

1.2.2免疫組織化學(xué)(SP)法：石蠟切片脫蠟、梯度乙醇逐級(jí)水化，PBS浸洗后以3%過(guò)氧化氫(H2O2)去離子水處理，PBS浸洗后用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸，PBS浸洗后加入山羊血清封閉液孵育15 min，滴加一抗[鼠抗人HBx單克隆抗體(1∶400)；兔抗人ANGPTL4多克隆抗體(1∶200)；以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照]，PBS浸洗后加入生物素標(biāo)記的二抗孵育1 h(37 ℃)，PBS浸洗后滴加SP溶液孵育1 h(37 ℃)，PBS浸洗后加入DAB溶液顯色，鏡檢顯色滿意后流水沖洗，蘇木精復(fù)染30 s，鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗10 min，返藍(lán)后流水沖洗，經(jīng)常規(guī)脫水、透明后封片。

1.2.3圖像分析：光學(xué)顯微鏡下閱片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)弱進(jìn)行半定量評(píng)分。HBx、ANGPTL4陽(yáng)性為胞膜、胞漿或胞核出現(xiàn)黃染顆粒。染色細(xì)胞數(shù)量陽(yáng)性細(xì)胞<5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者乘積0～3分為陰性(-)，4～6分為弱陽(yáng)性(+)，7～9分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，3分以上為陽(yáng)性(+)。

2 結(jié)果

2.1HBx、ANGPTL4蛋白表達(dá)比較 與癌旁組織比較，肝癌組織HBx表達(dá)陽(yáng)性率降低，ANGPTL4表達(dá)陽(yáng)性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 肝癌及癌旁組織HBx、ANGPTL4表達(dá)情況[例(%)]

2.2HBx、ANGPTL4表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系 肝癌患者HBx和ANGPTL4表達(dá)情況與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、甲胎蛋白(AFP)無(wú)關(guān)(P>0.05)，與包膜侵犯、門靜脈浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)(P<0.05，P<0.01);肝癌患者ANGPTL4表達(dá)與臨床分期有關(guān)(P<0.01),而HBx表達(dá)與臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 肝癌患者HBx、ANGPTL4表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

2.3HBx、ANGPTL4表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系 肝癌患者隨訪時(shí)間為7～58個(gè)月，Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)顯示HBx、ANGPTL4陽(yáng)性患者生存率低于陰性患者(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 HBx陽(yáng)性及陰性肝癌患者Kaplan-Meier生存曲線比較HBx為乙型肝炎病毒x蛋白

2.4肝癌預(yù)后因素分析 COX單因素分析及多因素分析示，肝癌患者包膜侵犯、門靜脈浸潤(rùn)、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HBx和ANGPTL4蛋白表達(dá)情況是影響預(yù)后的因素(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 98例肝癌患者預(yù)后影響因素的COX單因素及多因素分析

3 討論

HBx是HBV編碼的一種病毒蛋白，該基因位于病毒基因組核心區(qū)上游，其編碼的蛋白質(zhì)有154個(gè)氨基酸，目前認(rèn)為，HBx雖不能直接作用于宿主DNA序列，但可通過(guò)激活其他蛋白分子并促進(jìn)后者結(jié)合到宿主啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等結(jié)構(gòu)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7]。研究表明，在HBV相關(guān)性HCC中，HBx可通過(guò)結(jié)合到P53蛋白末端，阻礙其抗凋亡作用及修復(fù)功能，干擾對(duì)異常細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8]；另外，臨床研究也證實(shí)HBx的表達(dá)與肝癌新生血管生成關(guān)系密切，參與多種血管生成的信號(hào)通路及細(xì)胞調(diào)控作用[9]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織HBx陽(yáng)性率低于癌旁組織，與既往文獻(xiàn)類似[10-11]。有學(xué)者認(rèn)為，癌旁組織HBx表達(dá)較癌組織較高的原因可能是HBV感染狀態(tài)下基因與宿主基因嵌合到癌細(xì)胞DNA內(nèi)，通過(guò)突變、缺失等作用使特異性標(biāo)志物減少，這一改變也可幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，從而更快發(fā)展及增殖[12]。本研究結(jié)果顯示，HBx陽(yáng)性表達(dá)的患者具有更高的包膜侵犯率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，提示HBx陽(yáng)性表達(dá)與肝癌的發(fā)展相關(guān)。

ANGPTL4是血管生成素樣蛋白家族成員，廣泛表達(dá)于血管系統(tǒng)及內(nèi)臟脂肪組織中。目前認(rèn)為ANGPTL4可參與調(diào)控腫瘤形成，另外ANGPTL4作為一個(gè)與血管生成密切相關(guān)的基因，與腫瘤血管生成有調(diào)節(jié)作用[13]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，肝癌組織ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)率更高，且與包膜侵犯、門靜脈浸潤(rùn)、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床參數(shù)相關(guān)。既往關(guān)于ANGPTL4在肝癌中的表達(dá)研究不多，劉凱歌等[14]研究結(jié)果顯示ANGPTL4在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為63.76%，與門靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)，另外肝癌細(xì)胞系A(chǔ)NGPTL4蛋白水平表達(dá)也較正常肝細(xì)胞系顯著升高。本研究與其研究結(jié)果類似。

除與臨床病理的關(guān)系，本研究分析了兩種基因與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HBx、ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后更差，分析其原因：一方面肝癌作為一種血管相關(guān)性腫瘤，血管新生程度與腫瘤侵襲性密切相關(guān)，HBx、ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)者可能具有更快的血管生成速度及更強(qiáng)的侵襲性，治療后更易復(fù)發(fā)，預(yù)后更差。另一方面，部分分子的表達(dá)可能影響放化療的敏感性，既往研究表明，穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的肝癌細(xì)胞系對(duì)于順鉑敏感性較差，可能為預(yù)后較差的重要原因[15]。

綜上所述，肝癌組織HBx和ANGPTL4表達(dá)與患者臨床病理及預(yù)后相關(guān)，臨床可通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)情況判斷患者病情及預(yù)后。