關(guān)海寧，徐筱君，孫薇婷，劉登勇，刁小琴

（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

大豆分離蛋白（Soybean Protein Isolation，SPI）是大豆的主要組成成分之一，約占總蛋白的40%[1]。高壓處理對大豆蛋白結(jié)構(gòu)的改變和功能性質(zhì)的改善具有較大的潛力[2-3]，進而使大豆蛋白有目的、有方向性地表現(xiàn)出更好的功能特性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的多元化，從而使蛋白質(zhì)的利用價值得到提高[4]。高壓協(xié)同酶法水解蛋白獲得的水解產(chǎn)物具有諸多優(yōu)良的特性，安全無毒。Singh等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)，在350 MPa高壓環(huán)境下，濃度為10%卵清蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解5 min，其水解產(chǎn)物的抗氧化活性為19%，而未經(jīng)高壓處理的對照組僅為9.34%。Pe?as等[6]研究了超高壓100～300 MPa條件下，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、內(nèi)肽蛋白酶對乳清蛋白水解性能和產(chǎn)物功能性的影響，發(fā)現(xiàn)壓力為200 MPa和300 MPa協(xié)同酶解作用能夠降低乳清蛋白中過敏原蛋白段的致敏性。Garcia-mora等[7]考察了在100～300 MPa下，不同蛋白酶（復合蛋白酶、蛋白酶、胰蛋白酶以及堿性蛋白酶）對扁豆蛋白水解效果的影響，結(jié)果表明：300 MPa下的酶水解使扁豆蛋白完全變性，并且增強了小于3 kDa水解肽的富集，同時提升了水解產(chǎn)物在消化過程中抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶和氧自由基的吸收能力。Roy等[8]使用不同種類的酶水解深紅蕓豆蛋白，研究其水解產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)胃蛋白酶水解的蕓豆分離蛋白具有較強的DPPH自由基清除能力。然而關(guān)于蛋白高壓酶解物在經(jīng)過人體消化后，其抗氧化活性的變化鮮見報道。

模擬體外胃腸消化具有操作簡便、成本低、人性化等優(yōu)點。因此，本試驗采用體外模擬人體胃腸消化的方法，在評價超高壓對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)影響的基礎(chǔ)上，研究高壓酶解產(chǎn)物在不同消化階段消化產(chǎn)物的抗氧化活性的變化，以期為開發(fā)天然抗氧化功能肽提供理論依據(jù)，對大豆產(chǎn)物綜合開發(fā)的高新技術(shù)推廣與應用奠定理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

脫脂低溫豆粕（食品級）：哈高科大豆食品有限公司。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；Corolase PP（4 000 U/g，來自豬胰臟）：南京龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；胰脂酶和豬膽鹽：美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：天津市光復精細化工研究所；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

HHP-400超高壓設備：沈陽人和機電工程設備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析有限公司；F4500熒光分光光度計：日本日立有限公司；DDS-307型pH計：上海雷磁儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；普利賽斯XS系列原裝電子天平：上海銳析儀器設備有限公司；TDL-80-2B低速臺式離心機：湖南星科科學儀器有限公司；XH-C漩渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠；HD2010W電動攪拌器：上海司樂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

參照Jiang等[9]制備大豆分離蛋白的方法，以脫脂低溫豆粕為原料制備大豆分離蛋白，并將其用0.2 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制30 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，一部分用于直接高壓處理，另一部分加入底物質(zhì)量3%的Corolase PP酶混勻，將未加酶與加酶的蛋白溶液分別裝入3個雙層聚乙烯塑料袋中，每袋50 mL，抽真空密封后，置于高壓設備中，于50℃下進行高靜壓處理，以蒸餾水作為壓力傳遞介質(zhì)，設定處理壓力分別為100、200、300 MPa，每個壓力下的處理時間均為4 h，以常壓處理（0.1 MPa）為對照（CK）。高壓處理結(jié)束后，未加酶組冷卻至室溫，而加酶的處理組沸水浴滅酶10 min后冷卻至室溫，所有處理組均在4℃條件下8 000 r/min冷凍離心10 min，上清液冷凍干燥，高壓處理的SPI與高壓水解的大豆分離蛋白酶解物均于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色氨酸熒光光譜分析

參照Liu等[10]的方法并略作修改。使用10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液將高壓處理后的SPI樣品配制成0.2 mg/mL蛋白溶液。為了減少二聚酪氨酸的干擾，使用F-4500型熒光分光光度計在激發(fā)波長295 nm下以5 nm/s的速度掃描得到300～400 nm范圍的發(fā)射光譜，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）為空白。

1.2.3 大豆分離蛋白高壓酶解物的體外模擬消化研究

參考Li等[11]的方法，稍有改動。稱取2.4 g不同高壓處理的大豆蛋白酶解物，將其置于180 mL三口燒瓶中，加入50 mL蒸餾水，混合均勻，沸水浴5 min后冷卻至37℃，然后加入模擬胃液50 mL（37.5℃），混合均勻，將三口燒瓶置于37.5℃水浴中，進行電動攪拌（150 r/min）。反應時間4 h，每隔1 h取15 mL反應液，并迅速進行15 min沸水浴滅酶，冷卻后離心20 min（4 000 r/min），取上清液，將其置于0～4℃冰箱中保存。將上述剩余的反應液用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至5.5，加入預熱的模擬腸液150 mL，并用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，于37.5℃水浴中電動攪拌（150 r/min）。反應時間6 h，每隔1 h取15 mL反應液，并迅速進行沸水浴滅酶15 min，冷卻后離心20 min（4 000 r/min），取上清液在0～4℃冰箱中保存。

1.2.4 消化液抗氧化活性測定

不同時間段消化產(chǎn)物還原能力：參照Ma等[12]的吸光值法測定；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）清除能力：參照張淼[13]的方法測定；超氧陰離子自由基（O2·）清除能力：參照Chen等[14]的方法測定；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）清除能力：參照宋佳天[15]的方法測定；羥自由基（·OH）清除能力：參照金鳴等[16]的方法測定。

1.2.5 抑制脂質(zhì)體氧化能力測定

參照李媛媛等[17]的方法進行不同時間段消化產(chǎn)物的抑制脂質(zhì)體氧化能力的測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次，結(jié)果表示為xˉ±s，采用Statistix 8.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓條件下大豆分離蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

通常蛋白質(zhì)分子中含有一些內(nèi)源熒光的氨基酸殘基，但是由于色氨酸殘基和酪氨酸殘基空間位置的改變導致兩者之間的能量發(fā)生了轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為酪氨酸殘基熒光熄滅而色氨酸殘基熒光增強，因而蛋白質(zhì)的熒光主要是色氨酸殘基的熒光[18]。當?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，色氨酸殘基的位置和微環(huán)境會發(fā)生改變，表現(xiàn)出熒光光譜發(fā)生變化，進而可以反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[19]。圖1是超高壓下大豆分離蛋白與常壓對照組在310～370 nm范圍內(nèi)的熒光掃描圖。從圖中看出，對照組熒光出峰波值為334 nm，經(jīng)過超高壓處理后，樣品的λmax發(fā)生了一定的紅移（向長波方向移動），雖然紅移的幅度較小，但仍可以表明其三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得色氨酸熒光基團更傾向于親水的微環(huán)境[20]。

圖1 超高壓處理后大豆分離蛋白的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of soybean protein isolates after ultrahigh pressure treatment

與此同時，就熒光峰值的強度而言，經(jīng)過高壓處理后各樣品的強度隨著壓力的升高均呈現(xiàn)不同程度的升高，這表明更多的色氨酸基團在整個蛋白結(jié)構(gòu)中暴露或包裹的殘基比例發(fā)生變化；然而當壓力升到300 MPa，對比200 MPa，熒光強度反而降低，可能是300 MPa的高壓使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生了聚集變性。蘇丹等[21]也報道利用300 MPa處理大豆蛋白的相對熒光強度較200 MPa處理樣品的熒光強度有所降低，說明200～300 MPa可能導致了蛋白的可逆變性。

2.2 超高壓大豆分離蛋白酶解物體外消化產(chǎn)物的抗氧化性研究結(jié)果

2.2.1 消化過程中還原力的變化

圖2是超高壓下大豆分離蛋白酶解物體外消化產(chǎn)物鐵還原能力的變化曲線。從圖中看出：水解物在胃部消化階段，還原能力上升緩慢，說明鐵離子與消化不充分的大豆分離蛋白酶解物消化產(chǎn)物的金屬螯合能力較弱；然而進入腸消化階段，隨著消化時間的延長，其還原能力逐步增強，特別是在4～6 h時出現(xiàn)“爬坡”式攀升，但在隨后的腸消化過程中，其鐵還原能力趨于平穩(wěn)。這說明大豆分離蛋白酶解物在腸部消化過程中，由于肽鍵的裂解一方面使得更多的含組氨酸、蘇氨酸等非特異性蛋白組分暴露[22]，這些組分增強其還原能力的表現(xiàn)效果，另一方面隨著大豆分離蛋白酶解物消化程度的加深，更多的小分子多肽暴露，其更容易與鐵離子結(jié)合[23]，增強消化產(chǎn)物的抗氧化能力。消化6 h后，還原能力上升趨于平緩，可能是大部分酶解物已消化完成。在整個消化過程中，200 MPa處理的大豆分離蛋白酶解物的消化液鐵還原能力始終最強，可能是因為200 MPa壓力對于大豆分離蛋白原有的結(jié)構(gòu)影響較大，產(chǎn)生了特異性構(gòu)象，與此同時在酶解的過程中形成了部分特有的多肽結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果與上述熒光表征得出的結(jié)論相一致。另外，在之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，200 MPa處理的大豆分離蛋白酶解物與其他處理組相比產(chǎn)生了較多的小分子短肽[6]，林燕等[24]也發(fā)現(xiàn)分子量小于3 kDa的核桃小分子短肽具有較強的鐵還原能力。

2.2.2 消化過程中自由基清除能力的變化

由圖3可以看出，隨著消化時間的延長，消化產(chǎn)物對于ABTS自由基清除率表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，至胃蛋白酶消化后（4 h）清除率最低，一方面可能由于在胃消化階段，未消化完全的大分子蛋白消化液易與脂溶性DPPH自由基結(jié)合，進而阻礙了與水溶性ABTS自由基的結(jié)合[25]；另一方面可能是消化過程中較多疏水氨基酸側(cè)鏈的暴露影響了其與ABTS自由基的結(jié)合，因而清除率降低，但隨著胰蛋白酶的介入，蛋白繼續(xù)水解，更多的短肽和游離氨基酸不斷產(chǎn)生，其親水性得到改善，進而促進了ABTS自由基清除率的提高[26]。

圖3 消化液對ABTS自由基清除率的影響Fig.3 Effect of digestive juice on ABTS free radical scavenging rate

由圖4看出，在整個消化過程中，消化產(chǎn)物對于DPPH自由基清除率表現(xiàn)為先逐步上升，這可能是由于DPPH自由基屬于親脂性自由基，在疏水氨基酸側(cè)鏈暴露較多的條件下，更容易與之形成反應體系；然而當進入腸部模擬時，體系中親水氨基酸逐漸增加，破壞了原有的反應體系，使得反應優(yōu)勢驟降，在隨后短肽不斷產(chǎn)生的過程中，水解產(chǎn)物與油溶性DPPH自由基結(jié)合能力減弱，清除能力表現(xiàn)為輕穩(wěn)平升的態(tài)勢[13]。

圖4 消化液對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of digestive juice on DPPH free radical scavenging rate

與常壓對照組相比，200 MPa和300 MPa處理下大豆分離蛋白酶解物的消化液對ABTS·、DPPH·清除率均表現(xiàn)出比較好的優(yōu)勢，且200 MPa處理的酶解物其消化產(chǎn)物的清除能力更強，這可能與最初該壓力對其結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵性改良及產(chǎn)生了較多的小分子肽有關(guān)[6]。

圖5顯示了超高壓下得到的大豆分離蛋白酶解物體外消化液對超氧陰離子自由基清除率的影響變化趨勢。由圖5可以看出，隨著消化時間的延長，超氧陰離子自由基的清除能力呈現(xiàn)上升的趨勢，特別是進入到腸道消化階段，其遞增速度出現(xiàn)大幅度提升，而后又轉(zhuǎn)為平穩(wěn)提升，這可能是由于大豆分離蛋白酶解物在模擬腸道消化后水解產(chǎn)物能更有效地提供H質(zhì)子，進而提高了超氧陰離子自由基的清除能力，這一結(jié)論與王正旋[27]考察大米蛋白對超氧陰離子自由基清除的結(jié)果趨勢相一致。

圖5 消化液對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.5 Effect of digestive juice on superoxide free radical scavenging rate

由圖6看出，在模擬胃部消化階段，羥自由基的清除能力呈緩慢下降趨勢，這可能是由于胃蛋白酶與部分疏水性氨基酸的羧基端或氨基端作用，進而使羥自由基與多肽的結(jié)合能力減弱[28]；然而在模擬腸道消化階段，羥自由基清除能力又稍有小幅上升，這可能是酶解后增加的小分子多肽提高了羥自由基的清除能力。羥自由基在胃腸道消化階段不同的清除能力可能與蛋白分子在胃、腸道消化過程中產(chǎn)生的不同短肽有關(guān)，該結(jié)果與張淼[13]對玉米蛋白模擬體外消化的研究結(jié)果相一致。

圖6 消化液對羥自由基清除率的影響Fig.6 Effect of digestive juice on hydroxyl free radical scavenging rate

通過對圖5和圖6的進一步分析得出，200 MPa處理樣品的消化液在消化10 h時，超氧陰離子自由基清除率最高，達到79.7%，這與ABTS·和DPPH·清除率的影響效果相似；而消化液在消化4 h時，羥自由基清除率達58.6%，所有處理中最高，這進一步證實該壓力對大豆分離蛋白的改造具有較強的優(yōu)勢，同時結(jié)合酶解并形成了功能突出的特異性多肽結(jié)構(gòu)。

2.3 超高壓大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物體外消化產(chǎn)物抑制脂質(zhì)體氧化能力的分析

脂肪氧化的次級產(chǎn)物丙二醛與硫代巴比妥酸反應生成的硫代巴比妥酸反應物（TBARS），它是脂質(zhì)氧化過程中常用來評價被測物抑制脂肪氧化的重要指標之一。由圖7可以看出，不同高壓處理的大豆分離蛋白酶解物體外消化液的TBARS值呈現(xiàn)先升高后降低再緩慢升高的趨勢，特別是進入腸道消化階段，其下降趨勢呈現(xiàn)“斷崖”式跌落，這說明在進入到腸道消化后，消化液中的部分蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，具有抗氧化活性的基團暴露，抑制了丙二醛的形成，進而使TBARS值降低。此外，從該圖中還可以得出一個抗氧化表征共性的現(xiàn)象，即經(jīng)過200 MPa處理的樣品依然在此項研究中表現(xiàn)出良好的抗脂質(zhì)氧化的效果，在消化5 h時TBARS值最低，為0.369 mg/L。該研究結(jié)果與李媛媛等[17]對玉米蛋白水解物抑制脂質(zhì)氧化的研究結(jié)論相一致。

圖7 模擬消化過程中抑制脂質(zhì)體氧化能力的變化曲線Fig.7 Curve of inhibiting liposome oxidation during simulated digestion process

3 結(jié)論

上述試驗結(jié)果表明：超高壓對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)具有一定的改性作用，通過對其進行熒光光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在超高壓200 MPa條件下，一方面大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)會發(fā)生特異性變化，另一方面蛋白也可能會發(fā)生重新結(jié)合或聚合，使其結(jié)構(gòu)趨于更加穩(wěn)定，這就使得在超高壓結(jié)合酶的作用下，其水解產(chǎn)物更可能產(chǎn)生特殊形式及結(jié)構(gòu)的多肽組分；對不同壓力下的酶解產(chǎn)物進行體外消化試驗，得出經(jīng)超高壓200 MPa處理的大豆蛋白酶解物在體外消化10 h時還原能力最強（0.462），超氧陰離子自由基清除能力最強（79.7%），ABTS自由基清除能力最強（4.5%），在消化4 h時DPPH自由基清除率最高（96.8%），羥自由基清除率最高（58.6%），在消化5 h時抑制脂質(zhì)體氧化能力最強，其TBARS值最低，為0.369 mg/L。本研究對揭示因超高壓誘導蛋白水解物結(jié)構(gòu)變化從而影響體外消化產(chǎn)物抗氧化活性的作用機制提供了一定的理論依據(jù)，并對其促進抗氧化功能食品開發(fā)與應用具有一定的參考作用。