羅 娟 閆再宏 梁慧霞

河北中石油中心醫(yī)院消化內(nèi)科 (河北 廊坊， 065000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是臨床常見的肝病，包括非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、脂肪性肝炎(NASH)及NAFLD相關(guān)的肝纖維化及肝硬化，NASH是引起肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，早期確診、早期治療可延緩肝纖維化、肝硬化及惡變進(jìn)程[1]。因此在臨床工作中對NAFL與NASH的鑒別診斷非常重要，肝活檢是目前鑒別診斷NAFL和NASH的金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬于有創(chuàng)操作，技術(shù)要求高，且存在致命性并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，因此具有一定的局限性，未能在基層醫(yī)院普及開展[2]。

臨床上需要尋找其他更安全、簡便的方法來診斷、區(qū)分NAFL和NASH。NAFLD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，已有的研究認(rèn)為遺傳易感性、免疫功能紊亂、脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等均參與病情進(jìn)展[3]。故本研究旨在通過觀察不同程度NAFLD患者血清中炎癥因子及免疫因子的表達(dá)，探討血清炎癥因子及免疫因子在NAFLD病情診斷中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年1月在我院治療的NAFLD患者80例(NAFLD組)，根據(jù)脂肪肝程度分為：輕度患者25例，中度患者31例，重度24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合《非酒精性脂肪肝病防治指南(2018年更新版)》中的標(biāo)準(zhǔn)[4]；②無病毒性肝炎、藥物性肝炎等其他肝臟疾病者；③患者簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有精神疾病史者；②患者合并有惡性腫瘤、糖尿病、內(nèi)分泌疾病等其他疾病。同時(shí)選取健康體檢者80例作為對照組，兩組人群一般資料比較見表1。

表1 兩組人群一般資料比較

1.2 檢查方法 所有研究對象均于清晨抽取空腹靜脈血，分為兩份，一份在4℃條件下以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，取血清采用流式細(xì)胞學(xué)檢測IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平。經(jīng)包被、加酶標(biāo)抗體、加底物顯色、終止后在相應(yīng)波長處檢測吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。檢測儀器：美國伯騰公司ELX800多功能酶標(biāo)儀，試劑盒生產(chǎn)廠家：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。一份采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+、CD8+和CD4+CD25+，靜脈血以EDTA抗凝，加入紅細(xì)胞裂解液室溫孵育15 min，PBS洗滌2次。加入抗人抗體TITC-CD4、PE-CD8、APC-CD25，于4℃反應(yīng)40 min。加入固定劑室溫孵育15 min，PBS洗滌1次。加入穿透劑、抗人抗體PE-Foxp3，于4 ℃反應(yīng)40 min。檢測前用校準(zhǔn)熒光微球校正儀器，采用CellQuest軟件分析結(jié)果。檢測儀器：美國貝克曼庫爾特AQUIOS CL流式細(xì)胞儀。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群血清炎癥因子、免疫功能比較 NAFLD組患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和CD4+明顯高于對照組(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+明顯低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組人群血清炎癥因子、免疫功能表達(dá)水平比較

2.2 不同程度NAFLD患者血清炎癥因子、免疫功能比較 不同程度NAFLD患者性別、年齡及吸煙比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。重度NAFLD患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和CD4+表達(dá)水平明顯高于輕度和中度患者(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+表達(dá)水平明顯低于輕度和中度患者(P<0.05)；中度患者IL-17和IL-18表達(dá)水平明顯高于輕度患者(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+表達(dá)水平明顯低于輕度和中度患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同程度NAFLD患者血清炎癥因子、免疫功能比較

2.4 NAFLD組患者血清炎癥因子、免疫指標(biāo)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)性分析 將NAFLD組患者血清炎癥因子、免疫指標(biāo)與疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示：IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α、CD4+表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(rs=0.565、0.532、0.311、0.304和0.321，P<0.05)，CD8+和CD4+CD25+與嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.511和-0.503，P<0.05)。

3 討論

NAFLD以彌漫性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性、脂肪蓄積為病理特征，多數(shù)患者早期無明顯癥狀，偶見消化不良、肝區(qū)隱痛、肝脾腫大等非特異性癥狀或體征[5]。NAFLD的發(fā)生與不合理的飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，已逐漸發(fā)展為常見的慢性肝臟疾病，如不及時(shí)給予干預(yù)，可逐步進(jìn)展至肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重病變階段[6]。在臨床工作中，應(yīng)注意區(qū)分NAFL和NASH患者，但目前尚缺乏安全、操作簡便、價(jià)格低廉的診斷方法[7]。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前公認(rèn)的學(xué)說是“二次打擊”， 第一次打擊是由于高甘油三酯血癥導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂肪浸潤，導(dǎo)致胰島素抵抗。第二次打擊是多余的脂肪導(dǎo)致炎癥、纖維化、細(xì)胞壞死，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥細(xì)胞因子、內(nèi)毒素參與這一過程[8，9]。因此炎癥因子、免疫指標(biāo)可能對NAFLD病情具有一定的提示作用[10]。TNF-α是由脂肪組織中巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子，可引起外周胰島素抵抗，并能刺激激素敏感性脂肪酶，導(dǎo)致游離脂肪酸水平升高[11]。在肝臟中TNF-α由Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生，通過toll樣受體介導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生。IL-17是由CD4+和 CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12]。動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，IL-17與肝臟脂肪變性、NAFLD的發(fā)生相關(guān)，促進(jìn)NAFLD從單純性脂肪變性向NASH的轉(zhuǎn)變[13]。IL-18是由巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成的炎癥因子，可誘導(dǎo)趨化因子、粘附分子和其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可與內(nèi)毒素協(xié)同誘導(dǎo)肝臟損傷，導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化和壞死[14]。IL-22 的靶器官是肝臟，與急性期蛋白、組織修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)有關(guān)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平明顯高于健康體檢者，NAFLD重度患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平明顯高于輕度和中度患者；IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平與NAFLD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這一結(jié)果提示，可將IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α等指標(biāo)作為NAFLD診斷和病情評估的潛在輔助指標(biāo)。這是由于NAFLD病變可導(dǎo)致脂肪組織中的炎癥細(xì)胞分泌大量的炎癥因子，可引起胰島素抵抗、肝細(xì)胞炎性損傷。在這一病變過程中啟動一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)，引起IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平升高，其肝臟炎性損傷越嚴(yán)重，上述炎癥指標(biāo)水平越高。

NAFLD的發(fā)生、發(fā)展過程伴隨著免疫微環(huán)境的變化，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+表達(dá)異?？赡苁瞧洳±頇C(jī)制之一[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者CD4+水平明顯高于健康體檢者，而CD8+和CD4+CD25+水平明顯低于健康體檢者。NAFLD重度患者CD4+水平明顯高于輕度和中度患者，而CD8+和CD4+CD25+水平明顯低于輕度和中度患者。CD4+水平與NAFLD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，CD8+和CD4+CD25+水平與NAFLD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示，可將CD4+、CD8+和CD4+CD25+等指標(biāo)作為NAFLD診斷和病情評估的輔助指標(biāo)。這是由于CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的 主要反應(yīng)細(xì)胞，可增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞功能。CD8+T淋巴細(xì)胞對靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，并調(diào)節(jié)性抑制CD4+T淋巴細(xì)胞，兩者的穩(wěn)定比例維持細(xì)胞免疫平衡。NAFLD患者CD4+T淋巴細(xì)胞比例升高、CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降而引起機(jī)體免疫紊亂狀態(tài)。CD4+CD25+可通過分泌抑制性細(xì)胞因子、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控Th1/Th2平衡等途徑維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，延緩NAFLD病程進(jìn)展，其水平的下降可加重免疫紊亂狀態(tài)。

基于炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)在NAFLD病變過程中的重要作用，本研究選擇血清炎癥因子IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和免疫指標(biāo)CD4+、CD8+和CD4+CD25+為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清炎癥因子及免疫指標(biāo)異常，與患者嚴(yán)重程度存在一定相關(guān)性。今后可將其作為診斷和評估NAFLD病情的輔助指標(biāo)。但本研究并未能篩選上述指標(biāo)聯(lián)合檢測的特異性和敏感性，尚存在一定的不足，在今后的工作中可進(jìn)一步探討指標(biāo)聯(lián)合檢測的意義。