徐 燕 楊 蘊(yùn) 計(jì)張奕 崔溪溪 李玉芳

昆山市第一人民醫(yī)院腫瘤科 (江蘇 昆山, 215300)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害患者身心健康。因此，探究肝癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制對(duì)肝癌的靶向治療至關(guān)重要[1]。Engrailed-2(EN2)基因?qū)儆诜洽耦愅串愋秃屑易宄蓡T，近期研究顯示其在乳腺癌組織中表達(dá)水平高于正常組織[2]，而在腎癌中表達(dá)水平低于正常組織[3]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮雙向調(diào)控作用[4]。目前，該基因在肝癌中的研究不多，本研究通過體外培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，同時(shí)沉默EN2表達(dá)，探究沉默EN2后對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響以及可能的作用機(jī)制，為肝癌的靶向治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 肝癌細(xì)胞系HepG2購于中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所，保存在-80℃冰箱內(nèi)。

1.2 試劑與儀器 RPMI培養(yǎng)基、青霉素與鏈霉素、胰酶、DMSO(Gibco，美國)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、MTT、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen，美國)；兔抗EN2、辣根過氧化物酶標(biāo)記(Horse radish peroxidase，HRP)IgG、十號(hào)染色體上缺失的磷酸酯酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)、單抗(BD，美國)；CCK8檢測(cè)試劑、蛋白提取試劑盒(Taraka，日本)；p-PI3K、p-Akt、β-actin抗體(R&D，美國)；定量PCR儀、流式細(xì)胞儀(Backman，美國)；凝膠成像儀、垂直電泳槽購于(Bio-rad，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞從-80℃冰箱取出后置于37℃水浴中迅速解凍，添加含F(xiàn)BS的RMPI 1640培養(yǎng)基，1 000 rpm離心后，舍棄上層培養(yǎng)液加入PBS溶液清洗細(xì)胞，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)添加含F(xiàn)BS的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)80%細(xì)胞融合時(shí)，添加胰酶進(jìn)行消化，隨后添加含10%FBS、雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第三代用于后續(xù)研究。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期肝癌細(xì)胞系HepG2，接種細(xì)胞6孔板內(nèi)，每孔內(nèi)細(xì)胞密度均調(diào)整為5×105個(gè)/ml，加入不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)1 h，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為三組：空白對(duì)照組(Control組)：將轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞；陰性轉(zhuǎn)染組(NC-siRNA組)：將陰性序列NC-siRNA轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞；EN2-siRNA組：將EN2-siRNA序列轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，每組均設(shè)定6個(gè)重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后添加10%FBS、雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h，更換上層培養(yǎng)液為含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3 CKK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 分別收集三組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，密度調(diào)整為1.0×105個(gè)/孔，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)24、36、48、72 h添加CKK-8試劑，避光孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm溶液吸光度，計(jì)算EN2-siRNA對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響，細(xì)胞抑制率(%)=(空白組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/空白組吸光度×100%。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為200個(gè)/孔，接種細(xì)胞培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，待細(xì)胞出現(xiàn)克隆時(shí)(直徑超過1 mm計(jì)數(shù))，加入固定劑(甲硫醇:冰醋酸=1∶7)常溫下固定15 min后，采用0.1% Gimsa溶液染色30 min，PBS清洗、干燥后拍照肉眼統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后密度調(diào)整為2×105個(gè)/孔接種細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞，添加Annexin-V、PI染液，室溫下避光孵育15 min。通過30 μm篩網(wǎng)過濾單個(gè)細(xì)胞，Annexin-V和PI雙重染色壞死細(xì)胞，Annexin-V染色凋亡細(xì)胞，置于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后密度調(diào)整為2×105個(gè)/孔接種細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，置于冰冷乙醇中4℃環(huán)境中固定30 min，添加400 μg/mL RNA酶以及40 μg/ml PI，于37℃孵育30 min。置于流式細(xì)胞儀中分析細(xì)胞各時(shí)期DNA含量變化情況。

1.3.7 蛋白免疫印跡(WB) 加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣等量蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移PDVF膜上封閉后用PBS溶液清洗后加入添加一抗稀釋液(稀釋倍數(shù)1∶500)，37℃孵育2 h，添加HRP標(biāo)記IgG二抗(稀釋倍數(shù)：1∶5 000)室溫下孵育1 h，以β-actin蛋白表達(dá)作為內(nèi)參，采用凝膠分析儀軟件評(píng)估蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間對(duì)比采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩對(duì)比采用snk-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EN2沉默后轉(zhuǎn)染鑒定 Control組轉(zhuǎn)染后并未發(fā)出綠色熒光，NC-siRNA組、EN2-siRNA組發(fā)出大量熒光。熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上，見圖1。

圖1 各組EN2沉默后轉(zhuǎn)染情況 (×100)

2.2 EN2沉默后對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞EN2蛋白的影響 EN2-siRNA組細(xì)胞EN2蛋白表達(dá)顯著低于Control組、NC-siRNA組(P<0.05)，見圖2，表1。

圖2 WB檢測(cè)EN2沉默后EN2蛋白表達(dá)圖

表1 各組細(xì)胞中EN2蛋白表達(dá)比較

2.3 EN2沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 隨著時(shí)間的延長，EN2-siRNA組細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，EN2-siRNA組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于Control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見表2。

表2 EN2沉默對(duì)不同細(xì)胞組不同時(shí)間點(diǎn)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響比較

2.4 EN2沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞克隆數(shù)量的影響 EN2-siRNA組細(xì)胞克隆數(shù)量形成數(shù)目顯著低于Control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見圖3，表3。

圖3 各組細(xì)胞克隆形成情況

表3 各組細(xì)胞克隆數(shù)量情況比較

2.5 EN2沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響 EN2-siRNA組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于Control組和NC-siRNA組(P<0.05)，見圖4，表4。

圖4 EN2沉默后肝癌HepG2細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞圖

表4 各組細(xì)胞凋亡率情況比較

2.6 EN2沉默對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 EN2-siRNA組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著高于Control組、NC-siRNA組，S期細(xì)胞比例顯著低于Control組、NC-siRNA組(P<0.05)。三組細(xì)胞G2期無顯著變化(P>0.05)，見圖5，表5。

圖5 EN2沉默后HepG2細(xì)胞周期的變化細(xì)胞流式圖

表5 各組細(xì)胞周期變化情況比較

2.7 EN2沉默后對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響 EN2-siRNA組細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)顯著低于Control組、NC-siRNA組,PTEN蛋白高于Control組、NC-siRNA組(P<0.05)，見圖6，表6。

圖6 EN2沉默后p-PI3K、PTEN、p-Akt蛋白表達(dá)圖

表6 各組細(xì)胞中p-PI3K、PTEN、p-Akt蛋白比較

3 討論

HCC病死率在所有惡性腫瘤中位列第二，患者在早期無特異臨床癥狀，且腫瘤高轉(zhuǎn)移性，侵襲性導(dǎo)致腫瘤侵潤組織，已轉(zhuǎn)移組織難以完全清除，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[5,6]。傳統(tǒng)臨床治療方法如手術(shù)切除結(jié)合輔助放化療，雖具有一定的臨床療效，但仍有部分患者治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，肝癌仍是威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一[7]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌患者治療后5年內(nèi)生存率不足20%，預(yù)后極為不佳[8]。因此，探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，以此尋找新型治療靶點(diǎn)，探索新型治療策略，可為HCC提供新的治療思路。

EN-2為同源異型盒基因亞家族成員，在胚胎神經(jīng)發(fā)育以及成人神經(jīng)系統(tǒng)維持中發(fā)揮重要調(diào)控功能，大量證據(jù)顯示EN-2表達(dá)水平的異常可造成細(xì)胞的過度增殖，引發(fā)腫瘤[9,10]。EN-2在腫瘤中發(fā)揮雙向調(diào)控功能，在一部分腫瘤中扮演抑癌基因的角色，而在另一部分腫瘤中演原癌基因的角色[11]。Espíndula等[12]研究顯示EN2在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，且在動(dòng)物中證實(shí)小鼠乳腺細(xì)胞中過表達(dá)EN2后，小鼠出現(xiàn)乳腺細(xì)胞循環(huán)時(shí)間短以及細(xì)胞間連接缺失等腫瘤特征。Morgan等[13]研究顯示膀胱癌細(xì)胞中EN2呈高表達(dá)，干擾EN2的表達(dá)后能夠顯著抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。郭琦[14]發(fā)現(xiàn)抑制EN2表達(dá)后能夠減緩前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移，且同時(shí)可上調(diào) PAX2蛋白表達(dá)。Lai等[15]研究顯示在腎透明細(xì)胞癌組織中EN2呈現(xiàn)低表達(dá)或缺失表達(dá)，而在正常腎組織中呈高表達(dá)，且隨著分化程度升高，表達(dá)水平逐漸升高，提示在腎癌中EN2可能扮演抑癌基因的作用。然而在肝癌中發(fā)揮促癌還是抑癌作用，目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)NC-siRNA、EN2-siRNA組肝癌細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)率綠色熒光，EN-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步研究顯示EN2-siRNA組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示EN-2沉默后可有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

無限增殖為腫瘤細(xì)胞特征之一，根本原因在于腫瘤細(xì)胞周期失調(diào)。萇新偉等[16]研究顯示下調(diào)EN2表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖和侵襲。徐銀等[17]體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞時(shí)沉默EN2基因后，則細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期阻滯于G1期。本研究顯示EN2-siRNA組G1期細(xì)胞比例顯著高于NC組、Control組，S期細(xì)胞比例顯著低于NC組、Control組，提示EN2沉默后能夠引發(fā)肝癌細(xì)胞HepG2阻滯于G1期，推測(cè)EN2沉默后可能通過細(xì)胞周期阻滯，發(fā)揮腫瘤細(xì)胞抑制作用。

PTEN位于人染色體10q23.3，大量證據(jù)顯示其屬于抑癌基因，在甲狀腺癌、前列腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中PTEN均呈低表達(dá)[18,19]。吳金柱等[20]通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTEN在正常肝組織完全表達(dá)，在肝癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，PTEN陽性表達(dá)率與腫瘤組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，提示PTEN在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。PTEN/PI3K/AKT廣泛參與細(xì)胞凋亡，PI3P為PI3K的底物，PTEN可使PIP3脫磷酸化，進(jìn)而抑制PI3K/AKT通路，過往研究顯示，PTEN丟失后可使AKT持續(xù)磷酸化，激活PI3K/AKT通路，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤細(xì)胞抗凋亡作用。LI等[21]研究顯示干擾EN2基因表達(dá)后能夠顯著升高PTEN表達(dá)，提示EN2可能通過抑制PTEN蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲?；谝陨涎芯客茰y(cè)EN2干擾EN2基因表達(dá)后對(duì)PTEN/PI3K/AKT通路會(huì)有一定的影響。本研究結(jié)果顯示干擾EN2基因表達(dá)后能夠顯著升高PTEN表達(dá)，提示EN2沉默后可通過上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/AKT通路蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，EN2沉默后可促肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，可能通過上調(diào)PTEN蛋白、抑制PI3K/AKT通路，然而EN2沉默后是否同通過其它途徑影響肝癌的發(fā)生發(fā)展還有待后續(xù)深入研究。