李佳璐 王瑤 馬煥 李梅 李鹍 丁瑩瑩 陶海波

作者單位：①杭州醫(yī)學(xué)院附屬臨安人民醫(yī)院放射科（杭州市310000）；②昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院放射科；③昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院病理科

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，是青少年因腫瘤死亡的主要原因之一，好發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端，以股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端為主[1-2]。為準(zhǔn)確評(píng)估骨肉瘤新輔助化療療效，尋求能夠提供與術(shù)前療效相關(guān)的腫瘤組織學(xué)信息的影像評(píng)估手段尤為重要。研究表明，腫瘤壞死程度、微血管生成及乏氧狀態(tài)與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、療效密切相關(guān)[3-4]。目前，病理學(xué)上評(píng)價(jià)腫瘤微血管生成及乏氧情況最常用的方法是檢測(cè)腫瘤組織微血管密度（microvessel density，MVD）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和乏氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)水平[3-5]。MVD 和VEGF 可反映腫瘤微血管生成情況，是骨肉瘤抗血管生成治療研究的重要依據(jù)；HIF-1α 主要在腫瘤組織中表達(dá)，腫瘤乏氧區(qū)對(duì)化療藥物具有一定的耐藥性[3-4]。動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振成像（dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI）是一種定量灌注成像方法，已廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤[6]、乳腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、軟組織肉瘤[9]等惡性腫瘤微血管生成情況的評(píng)價(jià)，但應(yīng)用于骨肉瘤的研究相對(duì)較少。本研究采用MRI 影像與病理組織對(duì)照的方法，探究骨肉瘤DCE-MRI 圖像上病灶各感興趣區(qū)（region of interest，ROI）內(nèi)各定量參數(shù)（Ktrans、Kep、Ve、Vp）與相應(yīng)病理組織標(biāo)本的TNR、MVD、VEGF 及HIF-1α 表達(dá)水平之間的關(guān)系，旨在通過定量參數(shù)反映骨肉瘤腫瘤微環(huán)境中微血管生成及乏氧情況。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院2019年1月至2020年6月間經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的原發(fā)于股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端骨肉瘤患者10 例，其中男性9 例，女性1 例；年齡11～32 歲，中位年齡17.5 歲。發(fā)病部位為脛骨近端6 例，股骨遠(yuǎn)端4 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）所有患者就診前未接受任何治療；2）無MRI、新輔助化療（NAC）及手術(shù)禁忌證，化療方案為阿霉素+順鉑、甲氨蝶呤+長(zhǎng)春新堿、異環(huán)磷酰胺序貫化療；3）按期完成NAC 后行MRI 檢查，2 周內(nèi)行擴(kuò)大根治手術(shù)；4）MRI 影像資料均滿足數(shù)據(jù)測(cè)量要求。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者及監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 MRI 檢查及定量參數(shù)測(cè)量 采用Philips Ingenia 3.0 T MR 儀及膝關(guān)節(jié)線圈進(jìn)行檢查，依次行常規(guī)MRI 平掃、定量DCE-MRI、MRI 常規(guī)增強(qiáng)。常規(guī)平掃包括多體位T1WI、T2WI 及脂肪抑制T2WI 序列。定量DCE-MRI 采用擾相梯度回波快速3D-DYNAMIC 序列行矢狀位T1WI 連續(xù)多期動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描，序列參數(shù)：反轉(zhuǎn)角度分別為5°、15°，TE 2.0 ms、TR 4.0 ms、層厚3.5 mm、間距0、FOV 250×250 mm，第5 期結(jié)束后高壓注射器團(tuán)注對(duì)比劑（Gd-DTPA 0.1 mmoL/kg，2.5 mLs）并生理鹽水沖管（20 mL，2.5 mL/s），共掃描80 期，每期采集圖像24 幅，掃描時(shí)間4.7 s，共采集1 920 幅圖像。

使用GE Healthcare 血流動(dòng)力學(xué)軟件Omni Kinetics 分析DCE-MRI 圖像數(shù)據(jù)，以股動(dòng)脈為參考血管并勾畫動(dòng)脈輸入函數(shù)（AIF），選擇Extended Tofts linear 血流動(dòng)力學(xué)模型[10]。在與瘤段病理組織切片對(duì)應(yīng)的正中矢狀位影像層面建立坐標(biāo)系，按照瘤段切片分割的組織塊樣本定位并等比例勾畫1 cm×1 cm 大小ROI，測(cè)量各ROI 內(nèi)定量參數(shù)，包括容量轉(zhuǎn)移常數(shù)（volume transfer constant，Ktrans）、速率常數(shù)（rate constant，Kep）、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)（volume fraction，Ve）、血漿容積分?jǐn)?shù)（plasma volume fraction，Vp）（圖1）。同1 個(gè)AIF 重復(fù)測(cè)量3 次，取3 次測(cè)量的平均值為最終分析數(shù)據(jù)。

圖1 定量DCE-MRI

1.2.2 病理組織定位取材方法及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) MRI 檢查后2 周內(nèi)經(jīng)手術(shù)取得完整瘤段，沿正中矢狀面剖開，選擇一側(cè)剖面取5 mm 厚度切片，并網(wǎng)格狀分割為若干1 cm×1 cm 組織塊，依次進(jìn)行編號(hào)、制備蠟塊、H&E 染色、CD34、VEGF 及HIF-1α 免疫組織化學(xué)染色（圖2，3）。由兩名分別具有5年和10年以上工作經(jīng)驗(yàn)的骨腫瘤病理醫(yī)師判讀H&E 及免疫組織化學(xué)染色切片，評(píng)估TNR、計(jì)數(shù)MVD，并判斷VEGF、HIF-1α表達(dá)情況。TNR 根據(jù)Huvos 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]分級(jí)，MVD采用Weinder 計(jì)數(shù)方法[12]，VEGF 及HIF-1α 表達(dá)結(jié)果判讀參考《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[13]。

圖3 組織樣本影像及病理表現(xiàn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s或M（P25%，P75%）表示；計(jì)數(shù)資料采用絕對(duì)值或百分比（%）表示。采用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗(yàn)樣本的正態(tài)性及方差齊性。采用Poisson 回歸及Logistic 回歸分析DCE-MRI 定量參數(shù)與MVD、VEGF、HIF-1α 的關(guān)系并繪制受試者工作特征曲線（ROC），計(jì)算診斷閾值、敏感度和特異性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理樣本一般情況及TNR、MVD、VEGF、HIF-1α 表達(dá)情況

獲取完整瘤段10 例，腫瘤最大徑為4.4～20.7 cm，平均11.3 cm；分割組織塊共取得病理樣本507 個(gè)，排除H&E 染色證實(shí)非腫瘤組織樣本47 個(gè)，共460 個(gè)有效病理樣本納入分析。根據(jù)Huvos 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]，TNRⅠ級(jí)346 個(gè)（75.2%），Ⅱ級(jí)55 個(gè)（12.0%），Ⅲ級(jí)32 個(gè)（7.0%），Ⅳ級(jí)27 個(gè)（5.8%）。反應(yīng)良好組（TNR≥90%）為Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)，共59 個(gè)（12.8%），反應(yīng)差組（TNR＜90%）為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，共401 個(gè)（87.2%）。VEGF 陽性表達(dá)311 個(gè)（67.6%），陰性149 個(gè)（32.4%）。HIF-1α 陽性表達(dá)68 個(gè)（14.8%），陰性392 個(gè)（85.2%）。

2.2 病理樣本反應(yīng)良好組與反應(yīng)差組間DCE-MRI定量參數(shù)、MVD 計(jì)數(shù)、VEGF 及HIF-1α 表達(dá)情況比較

化療后，反應(yīng)良好組Ktrans、Kep、Ve、Vp均明顯高于反應(yīng)差組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。反應(yīng)良好組MVD 計(jì)數(shù)明顯高于反應(yīng)差組（Z/χ2=-4.067，P＜0.01)。反應(yīng)良好組VEGF 陽性率高于反應(yīng)差組，而HIF-1α 陽性率低于反應(yīng)差組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表2）。

表1 病理樣本反應(yīng)良好組與反應(yīng)差組間DCE-MRI 定量參數(shù)比較

表2 病理樣本反應(yīng)良好組與反應(yīng)差組間VEGF 及HIF-1a 比較 n（%）

2.3 DCE-MRI 定量參數(shù)與MVD 計(jì)數(shù)之間的關(guān)系

MVD 計(jì)數(shù)符合Poisson 分布，將lg（MVD）與DCE-MRI 定量參數(shù)帶入Poisson 回歸模型，經(jīng)逐步回歸篩選變量后，結(jié)果顯示Ktrans、Kep、Ve與MVD 具有相關(guān)性（均P＜0.01），其中Ktrans與MVD 呈負(fù)相關(guān)，Kep和Ve與MVD 呈正相關(guān)，回歸系數(shù)分別為-0.652、0.525、0.418；Vp與MVD 的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 DCE-MRI 定量參數(shù)與VEGF、HIF-1α 表達(dá)之間的關(guān)系

利用Logistic 回歸模型分析DCR-MRI 定量參數(shù)與VEGF、HIF-1α 關(guān)系，結(jié)果顯示Ve預(yù)測(cè)VEGF、Kep預(yù)測(cè)HIF-1α 的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ve＞0.634 時(shí)，預(yù)測(cè)VEGF 表達(dá)陽性的AUC 為0.609，敏感性為63.7%，特異性60.0%（圖4A）；當(dāng)Kep＞0.115 min-1時(shí)，預(yù)測(cè)HIF-1α 表達(dá)陽性的AUC 為0.614，敏感性為42.2%，特異性83.3%（圖4B）。

圖4 定量DCE-MRI 參數(shù)ROC 曲線預(yù)測(cè)VEGF 和HIF-1α 表達(dá)效能

3 討論

腫瘤組織微循環(huán)、新生血管狀態(tài)、細(xì)胞壞死及乏氧性等腫瘤異質(zhì)性因素與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、療效等密切相關(guān)[3-4]。定量DCE-MRI 技術(shù)具有實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、可重復(fù)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效的反映腫瘤血管的通透性和腫瘤組織的血液灌注并進(jìn)行定量評(píng)估，在腫瘤療效評(píng)價(jià)方面應(yīng)用廣泛[6-9]。

TNR 是評(píng)估骨肉瘤NAC 療效的病理學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”[5,11]。增殖活躍的腫瘤組織細(xì)胞排列密集，細(xì)胞外間隙小，新生血管豐富，不成熟微血管隨之增多，均導(dǎo)致微血管滲透性增高。因此，Ktrans、Ve、Vp值較高。隨著腫瘤生長(zhǎng)、體積增大及化療藥物作用，腫瘤細(xì)胞壞死增多，微血管密度減小，血管外細(xì)胞外間隙增大，故Ktrans、Ve、Vp值降低，Kep值升高，本研究結(jié)果與既往研究一致[6-9,14]。Guo 等[15]對(duì)69 例接受NAC 的骨肉瘤患者研究表明，反應(yīng)良好組（TNR≥90%）DCEMRI 定量參數(shù)值隨化療進(jìn)展明顯下降，其中Ktrans、Vp值在化療反應(yīng)良好組和反應(yīng)差組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），與本研究結(jié)果大致相同。因此，Ktrans和Ve預(yù)測(cè)骨肉瘤組織壞死情況具有意義。

腫瘤微血管生成及分布狀態(tài)與腫瘤增殖能力密切相關(guān)。MVD 能夠評(píng)估病灶內(nèi)微血管生成水平及分布情況。王東等[16]觀察70 例長(zhǎng)骨成骨肉瘤發(fā)現(xiàn)，微血管分布體現(xiàn)了骨肉瘤異質(zhì)性，在腫瘤外周區(qū)，以軟組織腫瘤成分為主，細(xì)胞增殖活躍，微血管密度高；在腫瘤中央?yún)^(qū)，以骨性成分為主，微血管密度低，瘤骨細(xì)胞增殖受限。隨訪所有患者生存期繪制生存曲線，結(jié)果表明骨肉瘤患者M(jìn)VD 與生存率相關(guān)。本研究中觀察樣本塊切片可見相似情況，在實(shí)性成分為主的軟組織腫瘤區(qū)，MVD 值高，多數(shù)微血管形態(tài)成熟，畸變率低，而在骨樣組織為主的瘤骨及骨化中心區(qū)，MVD 值低，微血管分化程度低。Jia 等[6]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中Ktrans與MVD 呈正相關(guān)（r=0.683，P＜0.001）。Liu 等[17]發(fā)現(xiàn)宮頸癌腫瘤組織MVD 較正常宮頸組織明顯升高，同時(shí)宮頸癌Ktrans、Kep、Ve值明顯高于正常宮頸組織。上述研究結(jié)果表明，定量DCE-MRI 在一定程度上能夠反映腫瘤微血管密度和分化程度。本研究中Ktrans與MVD 呈負(fù)相關(guān)，Kep、Ve與MVD 呈正相關(guān)，表明骨肉瘤組織樣本塊在微血管分布熱點(diǎn)區(qū)的微血管多高度分化，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，管壁不全、異形的微血管較少，致血管滲透性低。

VEGF 是腫瘤血管生成通路中最重要的啟動(dòng)誘導(dǎo)因子之一，不僅可促進(jìn)血管生成，而且還能催化腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。HIF-1α 表達(dá)升高在腫瘤缺氧的適應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用[3]。朱輝嚴(yán)等[18]研究乳腺癌DCEMRI 表現(xiàn)與VEGF 表達(dá)水平的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌VEGF 陽性表達(dá)率達(dá)80%，與乳腺癌MRI 邊緣毛刺（r=0.451，P=0.013）和早期邊緣強(qiáng)化（r=0.843，P=0.001）呈顯著正相關(guān)。韓文梅等[19]研究DCE-MRI診斷非小細(xì)胞肺癌及評(píng)估靶向藥物療效的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)DCE-MRI 診斷NSCLC 準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度分別高達(dá)98.08%、98.67%、83.33%；VEGF 陽性組患者最大強(qiáng)化率（maximum enhancement rate，MER）、強(qiáng)化斜率（slope of increase，Slope）水平均高于陰性患者（P＜0.05）；有效組患者M(jìn)ER、Slope 水平均高于無效組患者（P＜0.05）。譚建兒等[20]報(bào)道32 例膠質(zhì)瘤的HIF-1α 表達(dá)與Ktrans、Kep、Ve具有相關(guān)性（P＜0.05）。

雖然上述研究結(jié)果表明DCE-MRI 在腫瘤診斷及療效評(píng)估中均有較高價(jià)值，但DCE-MRI 大量的數(shù)據(jù)測(cè)量涉及ROI 的選取，大部分研究在腫瘤最大層面選取整個(gè)病灶作為感興趣區(qū)，未能將壞死、囊變、出血等區(qū)域剔除，并不能真實(shí)反映各區(qū)域腫瘤組織信息，這可能會(huì)影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性[6-9,14,18-19]。因此，本研究采用影像—病理位置匹配的方法，嚴(yán)格進(jìn)行影像感興趣區(qū)與病理樣本匹配，能夠更準(zhǔn)確反映每個(gè)病理組織塊TNR、MVD、VEGF 及HIF-1α 與定量參數(shù)之間的關(guān)系。本研究基于影像—病理對(duì)照結(jié)果提示DCE-MRI定量參數(shù)Kep、Ve評(píng)價(jià)骨肉瘤MVD、VEGF、HIF-1α有一定臨床價(jià)值，或可為骨肉瘤療效評(píng)估及臨床治療決策提供依據(jù)。

綜上所述，DCE-MRI 定量參數(shù)一定程度上能夠反映骨肉瘤腫瘤壞死、微循環(huán)血管生成及乏氧性，有望成為術(shù)前無創(chuàng)評(píng)估療效的方法。本研究也存在一定的局限性。首先，盡管位置匹配采集的大量組織樣本塊基本體現(xiàn)了腫瘤異質(zhì)性，但本研究為單中心研究，入組病例數(shù)較少，在反映人群個(gè)體化差別方面有所欠缺。其次，骨肉瘤骨化區(qū)域和軟組織區(qū)域在病理學(xué)形態(tài)和性質(zhì)方面有較大差別[21]，本研究未將二者區(qū)分開來，在結(jié)果反映上存在局限性。