賈麗娟 張?jiān)茝?qiáng) 綜述 張百紅 岳紅云 審校

作者單位：①甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（蘭州市730000）；②中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院腫瘤科；③中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院眼科；④甘肅省人民醫(yī)院普外二科

胃癌（gastric cancer，GC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率,目前在全球癌癥死亡率中位居第3 位[1]。GC 早期癥狀不典型，通常在進(jìn)展期被發(fā)現(xiàn)。目前，主要以手術(shù)治療為主，近年來(lái)GC 手術(shù)的規(guī)范化為患者的治療策略奠定了較好的基礎(chǔ)。同時(shí)，化療藥物、靶向藥物、免疫治療藥物的研發(fā)及應(yīng)用為不同發(fā)展階段的GC 患者治療提供了更多的選擇性。盡管如此，GC 患者的5年總生存率（overall survival，OS）仍較低[2]。GC 的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素和多基因參與的極其復(fù)雜的過(guò)程，因此深入研究GC 的發(fā)病機(jī)制成為人類亟待解決的難題。

近年來(lái)，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）RNA 表觀遺傳修飾成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。研究已證實(shí)m6A RNA 修飾異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其通過(guò)影響RNA 的轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯和代謝等過(guò)程影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。因此，本文就 m6A RNA 甲基化修飾在GC 發(fā)生發(fā)展中的作用以及化療耐藥做出綜述，旨在從表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面深入了解GC 的發(fā)病機(jī)制，為探索GC 靶向藥物治療提供新策略。

1 M6A 甲基化的概念

m6A 甲基化是指發(fā)生在RNA 中腺嘌呤（A）堿基的第6 位氮原子上的甲基化修飾，其是真核生物中mRNA 上最為常見的RNA 表觀遺傳修飾，不僅調(diào)控編碼RNAs，也修飾長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），主要富集在 mRNA 終止子附近的 3'非編碼區(qū)（3' untranslated region，3'UTR）[4]。m6A 甲基化修飾為一種動(dòng)態(tài)可逆的調(diào)控修飾，mRNA 在m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(m6A methyltransferase)的催化下發(fā)生甲基化,并在去甲基化酶（m6A demethylase）的作用下去掉甲基，重新恢復(fù)為腺苷；且甲基化的 mRNA 能夠被m6A 識(shí)別蛋白（m6A recognition protein） 選擇性識(shí)別結(jié)合，從而調(diào)節(jié)mRNA 的可變性剪接、出核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解，最終調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。目前，m6A甲基化的蛋白主要分為甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化轉(zhuǎn)移酶和m6A 識(shí)別蛋白。

m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶也稱“編碼器”（writers），主要由甲基轉(zhuǎn)移酶樣 3（methyltransferase like 3，METTL3）、METTL14、METTL16)、Wilms' 腫瘤蛋白 1 相關(guān)蛋白（Wilms' tumor 1-associating protein，WTAP）、RNA 結(jié)合模體蛋白 15（RNA binding motif protein 15，RBM15）、病毒樣m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白（virus like m6A methyltransferase associated protein，VIRMA，又稱為KIAA1429）、鋅指CCCH 型結(jié)構(gòu)域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13，ZC3H13）、Casitas B 系淋巴瘤原癌基因轉(zhuǎn)化序列樣蛋白1（Casitas Blineage lymphoma-trans forming sequence-like protein 1，CBLL1）又稱為HAKAI，均為核心組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化mRNA 上的堿基發(fā)生m6A 甲基化修飾。在催化 m6A 形成的過(guò)程中，METTL14 與 METTL3 形成異二聚體發(fā)揮催化作用，其中METTL3 具有催化活性的亞基，負(fù)責(zé)將甲基增加到腺嘌呤第6 位氮原子；METTL14 通過(guò)結(jié)合mRNA 并協(xié)助甲基定位，負(fù)責(zé)識(shí)別底物；WTAP 通過(guò)穩(wěn)定METTL3 與METTL14 的相互作用發(fā)揮調(diào)節(jié)亞基的作用；KIAA1429 通過(guò)募集甲基轉(zhuǎn)移酶核心成分METTL3/METTL14/WTAP，介導(dǎo)3′UTR 和終止密碼子區(qū)域選擇性m6A 修飾；RBM15 可作為銜接蛋白招募WTAP/METTL3 復(fù)合物，使其選擇性地在特定的m6A 共識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行甲基化；ZC3H13 調(diào)控WTAP 在RNA 上的募集并促進(jìn)m6A 修飾，主要負(fù)責(zé)與RBM15 的連接，發(fā)揮支架作用協(xié)助ZC3H13/WTAP/KIAA1429（VIRMA)/HAKAI復(fù)合物進(jìn)行核定位，確保m6A 沉積到靶向轉(zhuǎn)錄本上調(diào)控m6A 修飾水平的動(dòng)態(tài)變化；METTL16 是新發(fā)現(xiàn)的具有催化活性的m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶，與METTL3、METTL14 同源，可以靶向結(jié)合U6 小核 RNA（U6 snRNA)引起U6 第43 位的腺嘌呤發(fā)生m6A 甲基化修飾，從而影響U6 snRNP對(duì)mRNA 前體的剪接。

m6A 去甲基酶稱為“消碼器”（erasers），能夠“擦除”mRNA 上的m6A 甲基。m6A 去甲基化酶的成分主要包括脂肪質(zhì)量與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO）基因和烷基化修復(fù)同源物3/5（alkylation repair homolog 3，ALKBH3）、ALKBH5，保證了m6A 的動(dòng)態(tài)可逆過(guò)程，可去除m6A 甲基化，從而通過(guò)影響 m6A 甲基化腺苷去甲基化調(diào)控mRNA 加工、輸出和代謝過(guò)程。

m6A 結(jié)合蛋白稱為“讀碼器”（readers），能夠選擇特異性識(shí)別mRNA 的m6A 甲基化位點(diǎn)，主要有 YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白（YTH domain family 1/2/3，YTHDF1/2/3）和（YTH domain containing 1/2，YTHDC1/2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白1/2/3（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP1/2/3）、異質(zhì)核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HnRNPs） [異質(zhì)核核糖核蛋白C（HnRNPC） 、異質(zhì)核核糖核蛋白G（HnRNPG）、RNA 結(jié)合蛋白異質(zhì)核蛋白A2B1（HnRNPA2B1）] 及真核細(xì)胞起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）。這些蛋白能與m6A 位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn) mRNA 選擇性剪接、降解、翻譯、核輸出及穩(wěn)定性。

2 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶

2.1 METTL3

METTL3 是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的主要催化成分，其表達(dá)異?？筛淖?m6A mRNA 的命運(yùn)，從而影響GC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡。Yue 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，METTL3 表達(dá)水平升高與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)METTL3 有助于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）過(guò)程和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在GC 中含1 的鋅指MYM 型（zinc finger MYM-type containing 1，ZMYM1）為METTL3的m6A 靶標(biāo)。METTL3 通過(guò)依賴m6A 的方式調(diào)控修飾 ZMYM1 mRNA， 提升ZMYM1 的穩(wěn)定性；ZMYM1 通過(guò)招募 CtBP/LSD1/COREST 復(fù)合物與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）啟動(dòng)子相互作用，介導(dǎo)抑制Ecadherin 的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)EMT 程序和轉(zhuǎn)移,從而影響GC 細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。另有研究[6]發(fā)現(xiàn)METTL3在GC 中發(fā)揮致癌作用，敲除METTL3 可抑制GC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)METTL3可誘導(dǎo)失活A(yù)KT 信號(hào)通路，主要通過(guò)降低AKT 磷酸化水平和下游效應(yīng)因子p70S6K 和cyclin D1 的表達(dá)而抑制GC 細(xì)胞增殖；同時(shí)，METTL3下調(diào)增加了凋亡正性因子Bax 和caspase-3 表達(dá)，降低了凋亡負(fù)性因子Bcl-2 的表達(dá)，進(jìn)而激活凋亡通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該研究提示下調(diào)METTL3 可能通過(guò)失活A(yù)KT 信號(hào)通路和促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制GC 細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移和侵襲，有望成為治療GC 的潛在靶點(diǎn)。Wang 等[7]的研究表明，METTL3 在GC 組織中的表達(dá)明顯升高，并與不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)p300 介導(dǎo)METTL3 啟動(dòng)子中H3K27 乙?；罨龠M(jìn)METTL3轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)METTL3 的下游靶向基因HDGF 的表達(dá)，增加其mRNA m6A 修飾和提高HDGF mRNA的穩(wěn)定性。分泌型HDGF 能促進(jìn)腫瘤血管生成，而核型HDGF 能激活GLUT4 和ENO2 的表達(dá)增加細(xì)胞糖酵解的能力。該研究提示METTL3/HDGF/GLUT4/ENO2 軸通過(guò)增加糖酵解和血管生成的能力促進(jìn)GC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Liu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，METTL3 在GC患者中顯著表達(dá)，并且隨著腫瘤分期和分級(jí)的進(jìn)展，METTL3 的表達(dá)水平逐漸升高。此外，敲除METTL3可降低EMT 相關(guān)蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，從而抑制GC 細(xì)胞增殖和遷移能力。另有研究[9]報(bào)道了METTL3 高表達(dá)與GC 患者的臨床病理特征和較差的生存期顯著相關(guān)，敲除METTL3 能有效抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步RNA-seq 和m6Aseq 分析發(fā)現(xiàn)METTL3 可通過(guò)調(diào)控MYC 靶基因上的關(guān)鍵蛋白（如MCM5、MCM6 等）介導(dǎo)m6A 修飾而促進(jìn)GC 發(fā)生發(fā)展。此外，Yang 等[10]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在GC 組織和細(xì)胞中METTL3 和MYC 的表達(dá)均上調(diào)；并且METTL3 通過(guò)提高M(jìn)YC m6A 甲基化水平，促進(jìn)了MYC 蛋白的翻譯，從而增強(qiáng)GC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Jiang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在GC 細(xì)胞中敲除METTL3 可導(dǎo)致GC 細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào)抑制（SOCS）蛋白家族SOCS2 表達(dá)增加，且SOCS2 的表達(dá)與GC 細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。提示GC 細(xì)胞中METTL3 下調(diào)可誘導(dǎo)SOCS2 表達(dá)增加而抑制GC 細(xì)胞增殖。最近的一項(xiàng)研究[12]發(fā)現(xiàn)，m6A 和METTL3表達(dá)水平在GC 中升高，且METTL3 表達(dá)升高提示患者的惡性程度較高及預(yù)后較差。METTL3 通過(guò)依賴m6A/DGCR8 的方式促進(jìn)pri-miR-17-92 進(jìn)入致癌miR-17-92 簇,而miR-17-92 能夠靶向抑制腫瘤抑制因子PTEN 或TMEM127 的表達(dá)激活腫瘤AKT/mTOR通路，從而促進(jìn)GC 的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

2.2 METTL14

METTL14 在GC 中發(fā)揮抑癌作用。Liu 等[13]通過(guò)分析臨床樣本和生物信息學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)METTL14 在GC 組織的表達(dá)水平低于癌旁組織，且METTL14 表達(dá)與TNM 分期顯著相關(guān)；Kaplan-Meier 顯示METTL14高表達(dá)患者的預(yù)后優(yōu)于METTL14低表達(dá)患者。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)METTL14 下調(diào)增加了腫瘤激活因子PI3K、AKT 和mTOR 蛋白磷酸化水平，而METTL14 過(guò)表達(dá)降低了上述蛋白的表達(dá)而抑制GC 細(xì)胞增殖和侵襲。此外，研究METTL14 與EMT相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)METTL14 過(guò)表達(dá)組中EMT 相關(guān)的蛋白vimentin、N-cadherin、MMP9 蛋白低表達(dá)，而Ecadherin 蛋白高表達(dá)；而METTL14 下調(diào)時(shí)，上述蛋白的表達(dá)相反，從而促進(jìn)EMT 過(guò)程增強(qiáng)GC 細(xì)胞的遷移和侵襲。提示METTL14 通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 通路和調(diào)控EMT 通路來(lái)抑制GC 細(xì)胞的進(jìn)展和侵襲，有望成為GC 中一個(gè)新興的生物標(biāo)志物。

2.3 WTAP

WTAP 作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物輔助因子，在調(diào)控m6A 甲基化修飾過(guò)程中具有重要的作用。最新的兩項(xiàng)研究證實(shí)WTAP 在GC 中扮演致癌基因的作用。一項(xiàng)研究利用組織芯片和癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集檢測(cè)WTAP 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)WTAP 在GC 中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)，證實(shí)了WTAP 的表達(dá)是GC 生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)WTAP 的表達(dá)與腫瘤免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，WTAP 低表達(dá)可通過(guò)增加免疫調(diào)節(jié)核心基因的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤免疫功能，從而抑制GC 的增殖并同時(shí)提高患者的生存預(yù)后；而WTAP 高表達(dá)可抑制腫瘤免疫功能而提升GC 的增殖能力[14]。這提示W(wǎng)TAP可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫功能影響GC 的發(fā)生發(fā)展。另一項(xiàng)研究[15]利用m6A 免疫沉淀測(cè)序分析（m6A immun oprecipitation sequencing analysis，MeRIP-Seq）分析證實(shí)WTAP 和m6A 在GC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)均上調(diào)，且WTAP 的高表達(dá)與GC 患者預(yù)后不良密切相關(guān)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)WTAP 與GC 的Warburg 效應(yīng)（又稱有氧糖酵解，是指癌癥中葡萄糖代謝和能量供應(yīng)異常）有關(guān)；利用體外功能實(shí)驗(yàn)表明，WTAP 過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的增殖和提高糖酵解能力；而體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)表明，沉默WTAP 可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步使用MeRIP-Seq 和MeRIP-qPCR 研究發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝指標(biāo)HK2 為WTAP 的靶標(biāo)，WTAP 可與3'UTR m6A 位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而增強(qiáng)HK2 mRNA 的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)GC 細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。該研究提示W(wǎng)TAP 通過(guò)增強(qiáng)HK2 表達(dá)和參與調(diào)節(jié)Warburg 效應(yīng)在GC 中發(fā)揮致癌作用，為GC 的治療提供了新的途徑和靶點(diǎn)。

2.4 KIAA1429（VIRMA）

KIAA1429 作為支架連接m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的催化核心成分，其在GC 中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。最新的研究[16]采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白印跡法檢測(cè)KIAA1429 在GC 組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KIAA1429 在GC 組織表達(dá)較癌旁組織表達(dá)高。功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)KIAA1429 可促進(jìn)GC 細(xì)胞增殖，而下調(diào)KIAA1429 可抑制GC 細(xì)胞增殖。通過(guò)mRNA 高通量測(cè)序和RNA 免疫沉淀法（RNA immunoprecipitation，RIP）分析發(fā)現(xiàn)，c-Jun是KIAA1429潛在的調(diào)控基因。值得關(guān)注的是，KIAA1429 能通過(guò)非依賴m6A 的方式調(diào)控c-Jun 的表達(dá)；此外，c-Jun 過(guò)表達(dá)可解除KIAA1429 基因下調(diào)引起的GC 細(xì)胞增殖抑制。該研究提示KIAA1429 在GC 中發(fā)揮致癌作用，可作為GC 潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

2.5 METTL16

METTL16 是一種新發(fā)現(xiàn)的m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶，主要甲基化 mRNA 的 3'非翻譯區(qū)的 m6A 位點(diǎn)。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，METTL16 在GC 細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與GC 患者預(yù)后不良相關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)METTL16 可促進(jìn)GC 細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。此外，下調(diào)METTL16 可通過(guò)阻斷G1 期向S 期轉(zhuǎn)化進(jìn)程抑制細(xì)胞增殖；進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1 是METTL16 的下游調(diào)控蛋白；敲除METTL16 可降低GC 細(xì)胞中m6A 的整體水平和cyclin D1 mRNA的穩(wěn)定性及其表達(dá)。該研究表明，METTL16 在GC中具有促癌作用，通過(guò)介導(dǎo)m6A 甲基化水平增強(qiáng)cyclin D1 mRNA 的穩(wěn)定性，上調(diào)cyclin D1 的表達(dá)，從而促進(jìn)GC 細(xì)胞的增殖和侵襲，這為探索GC 治療的有效策略提供了可能的途徑。

2.6 RBM15/15B

RBM15 是Split Ends（SPEN）蛋白家族的成員，是保守的RNA 結(jié)合蛋白，其可以通過(guò)與剪接體成分相互作用與RNA 結(jié)合。研究者通過(guò)檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中GC 患者的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RBM15 與總生存率（overall survival，OS）密切相關(guān)；并且建立RBM15 的GC 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)RBM15 的HR＜1，可作為GC 的保護(hù)基因。進(jìn)一步體外利用RTPCR 技術(shù)檢測(cè)RBM15 結(jié)果顯示，與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1 相比，RBM15 在GC 細(xì)胞中弱表達(dá)且RBM15 mRNA 表達(dá)下調(diào)。此外，利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)GC組織和相鄰組織中RBM15 蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBM15 在癌旁組織中高表達(dá)，在癌組織中弱表達(dá)[18]。該研究標(biāo)明，RBM15 在GC 中可能發(fā)揮抑癌作用。然而，截至目前，關(guān)于RBM15 在GC 中的表達(dá)及功能的研究非常有限，未來(lái)仍有很大的發(fā)展空間。

3 m6A 去甲基轉(zhuǎn)移酶

3.1 FTO

FTO 是最早發(fā)現(xiàn)的 m6A 去甲基化酶,研究發(fā)現(xiàn)FTO 與GC 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，有望成為監(jiān)測(cè)GC 預(yù)后的重要分子靶標(biāo)。研究者通過(guò)采用組織芯片免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GC 組織和癌旁正常組織中FTO 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FTO 在GC 組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FTO 表達(dá)水平與低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且與TNM 分期呈正相關(guān)；Kaplan-Meier 分析顯示，高FTO 表達(dá)與GC 患者預(yù)后不良顯著相關(guān)[18-19]。Zhang 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，低m6A 信號(hào)與GC的不良臨床病理特征有關(guān)；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)FTO 過(guò)表達(dá)，可降低 RNA m6A 甲基化水平，激活 Wnt/PI3K-AKT通路而促進(jìn)GC 的惡性表型。Yang 等[21]利用RT-qPCR和Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示GC 組織中MYC 表達(dá)升高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 可以去除MYC 基因5′端m6A 修飾，降低GC 細(xì)胞中MYC m6A mRNA 表達(dá)水平，增加MYC mRNA 穩(wěn)定性，進(jìn)而提高M(jìn)YC 在GC 中的表達(dá)，最終促進(jìn)GC 的增殖；相反，沉默F(xiàn)TO后，MYC 表達(dá)下調(diào)，抑制GC 的增殖。該研究驗(yàn)證了FTO/m6A/MYC 軸在GC 靶向表觀遺傳修飾中的致癌潛力。

3.2 ALKBH5

ALKBH5 在GC 中異常表達(dá)，但目前其在GC 中的作用尚未明確。陸瑛等[22]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 在彌漫性胃腺癌中的表達(dá)低于正常胃黏膜組織。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5 表達(dá)下調(diào)后，mRNA去甲基化能力下降，E-cadherin mRNA 的穩(wěn)定性減低，從而使細(xì)胞的極性和骨架結(jié)構(gòu)變得更為疏松而更具侵襲性。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 過(guò)表達(dá)，可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9 表達(dá)而降低EMT 水平，從而抑制GC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力。然而，Zhang 等[23]的研究與上述的研究結(jié)果相反，該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)ALKBH5能夠潛在結(jié)合lncRNA NEAT1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1），且發(fā)現(xiàn)NEAT1 和ALKBH5在GC 中顯著過(guò)表達(dá)，同時(shí)兩者高表達(dá)與GC 中的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ALKBH5與NEAT1的表達(dá)呈正相關(guān)，敲除ALKBH5上調(diào)NEAT1 RNA 的m6A 水平，可抑制GC 中NEAT1 的表達(dá)；此外，敲除NEAT1 能夠顯著抑制GC 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5 和NEAT1 通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)EZH2（多梳抑制復(fù)合體的一個(gè)亞基）的表達(dá)加速惡性表型的形成，從而影響GC 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。該研究表明，ALKBH5 通過(guò)去甲基化lncRNA NEAT1促進(jìn)GC 侵襲和轉(zhuǎn)移，ALKBH5/ lncRNA NEAT1/ EZH2軸可能是GC 潛在的治療靶點(diǎn)。

4 m6A 結(jié)合蛋白

4.1 YTH 結(jié)構(gòu)域家族

YTH 結(jié)構(gòu)域家族蛋白與含有m6A 的 mRNA 結(jié)合，可調(diào)控mRNA 的定位和穩(wěn)定性，該家族蛋白與GC 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。一項(xiàng)研究[24]通過(guò)分析不同人類癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)的多種生物信息，發(fā)現(xiàn)約7%的GC 患者發(fā)生了YTHDF1 突變，且YTHDF1 高表達(dá)與腫瘤高增殖侵襲率和總生存期較差相關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，下調(diào)YTHDF1 可抑制GC 細(xì)胞的增殖。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)YTHDF1 以依賴m6A 的方式促進(jìn)Wnt 通路關(guān)鍵受體蛋白7（frizzled 7，F(xiàn)ZD7）的翻譯，從而增強(qiáng)FZD7 的表達(dá)，最終激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)GC 的發(fā)生。該研究結(jié)果證實(shí)了YTHDF1 及其m6A介導(dǎo)的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在GC 中的致癌作用。此外，另有[25]研究通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)GC 患者的m6A 基因進(jìn)行全面分析，也發(fā)現(xiàn)YTHDF1 在GC 中的表達(dá)上調(diào)，且 YTHDF1的高表達(dá)與高危型GC 患者顯著相關(guān)，提示YTHDF1 可能是GC 早期診斷的潛在靶點(diǎn)。最新的一項(xiàng)研究進(jìn)一步證明YTHDF1 在GC 組織中高表達(dá)，且YTHDF1 的上調(diào)與GC 分期、癌灶、腫瘤大小及預(yù)后不良顯著相關(guān)，是GC 患者生存不良的獨(dú)立預(yù)后因素。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)YTHDF1 可抑制GC 細(xì)胞增殖和侵襲，以及抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和肺轉(zhuǎn)移，并可同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RNAseq、MeRIPseq 和RIP-seq 的交叉實(shí)驗(yàn)表明，USP14 是YTHDF1的下游靶點(diǎn)，且USP14 表達(dá)上調(diào)與YTHDF1 表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)YTHDF1 能夠以依賴m6A 的方式促進(jìn)USP14 蛋白的翻譯，從而促進(jìn)GC 的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[26]。該研究表明，YTHDF1-USP14 在GC 的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，為GC 的預(yù)后、治療或診斷提供了重要依據(jù)。Shen 等[27]分析公共數(shù)據(jù)庫(kù)GC 患者中YTHDF2 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)YTHDF2 在GC 組織表達(dá)明顯低于正常胃黏膜組織，且YTHDF2 的低表達(dá)與GC 臨床分期和患者的生存預(yù)后密切相關(guān)；進(jìn)一步通過(guò)RNA-Seq 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YTHDF2 與叉頭蛋白C2（forkhead box protein C2，F(xiàn)OXC2） 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且YTHDF2 可通過(guò)負(fù)向調(diào)控FOXC2 表達(dá)水平抑制GC 的惡性增殖。該研究提示YTHDF2 在GC 中扮演抑癌作用，有望為臨床上治療GC 提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

4.2 IGF2BPs

m6A 結(jié)合蛋白 IGF2BPs 在GC 中異常表達(dá)。以往的研究已經(jīng)證實(shí)前蛋白易位因子SEC62 具有致癌功能，He 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，SEC62 在GC 中呈高水平表達(dá)，且下調(diào)SEC62 可抑制GC 細(xì)胞的增殖同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，METTL3 與SEC62 mRNA相互作用可誘導(dǎo)修飾SEC62 mRNA 上的m6A，從而促進(jìn)IGF2BP1 對(duì)SEC62 mRNA 的穩(wěn)定作用，最終促進(jìn)GC 的進(jìn)展。Wang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，m6A 修飾基因IGF2BP1、IGF2BP2 和IGF2BP3 在GC 組織中的mRNA 表達(dá)顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1 表達(dá)水平較高提示患者的總生存期較差，該研究表明IGF2BP1 在GC 中可能發(fā)揮致癌作用。有研究[30]為確定IGF2BP1 參與GC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移情況，將IGF2BP1 siRNA 靶向轉(zhuǎn)染到人GC 細(xì)胞SGC7901和MGC803 中，功能實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)IGF2BP1 能顯著抑制GC 細(xì)胞的增殖。此外，敲除IGF2BP1 能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并伴有Bax 表達(dá)升高和Bcl-2、Bcl-Xl 表達(dá)降低，同時(shí)導(dǎo)致GC 細(xì)胞周期S 期檢查點(diǎn)蛋白質(zhì)CDK2、cyclin A2 表達(dá)減少及細(xì)胞周期S 期阻滯，從而顯著抑制GC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。免疫組織化學(xué)分析顯示IGF2BP1 在GC 組織中高表達(dá)且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。該研究結(jié)果進(jìn)一步揭示出IGF2BP1 在GC 中發(fā)揮致癌作用。此外，Shen 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01559 在GC 細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示沉默LINC01559 可抑制GC 細(xì)胞的增殖、遷移和EMT 過(guò)程。此外，染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）實(shí)驗(yàn)表明，作為轉(zhuǎn)錄因子的（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）可與LINC01559 的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)GC 細(xì)胞中LINC01559 的表達(dá)；而LINC01559 通過(guò)招募IGF2BP2 穩(wěn)定ZEB1 mRNA 的表達(dá)促進(jìn)GC 的進(jìn)展。該研究證實(shí)ZEB1 誘導(dǎo)的LINC01559 通過(guò)招募IGF2BP2 穩(wěn)定ZEB1 mRNA 表達(dá)，從而加速GC 細(xì)胞增殖、遷移和EMT 過(guò)程。

4.3 EIF

EIF3 是最大的真核起始因子，具有m6A 的讀碼功能，在翻譯起始進(jìn)程中起著核心作用。He 等[32]研究發(fā)現(xiàn)， EIF3D 在GC 中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與GC不良臨床預(yù)后顯著相關(guān)。另有研究[33]使用cBioPortal和Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)在GC 樣本中存在EIF3H基因改變（突變、缺失和擴(kuò)增），并且 EIF3H mRNA 在GC 組織中也上調(diào)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)EIF3H 可使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期而抑制GC 細(xì)胞的增殖；同時(shí)通過(guò)上調(diào)促凋亡因子和下調(diào)抗凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示EIF3H 可作為臨床治療GC 的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。此外，EIF3B 是EIF3 復(fù)合物的主要支架亞基，在mRNA 翻譯、細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。Ma 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，EIF3B 在人慢性胃炎和GC 組織中表達(dá)上調(diào)，且EIF3B 的表達(dá)與GC的分期和進(jìn)展有關(guān)。提示幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染可上調(diào)GC 細(xì)胞中EIF3B 的表達(dá)，提示EIF3B 可能參與了Hp 的致癌過(guò)程。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)下調(diào)EIF3B 可以通過(guò)調(diào)控癌相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制GC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，另有研究[35]顯示EIF3B 在GC 組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且EIF3B 高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期及不良預(yù)后顯著相關(guān)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)EIF3B 通過(guò)調(diào)控EMT 和STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；同時(shí)基因富集分析（GSEA）和Western blot 結(jié)果表明，上調(diào)EIF3B 表達(dá)能增強(qiáng)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)GC 的進(jìn)展。敲除EIF3B 可以抑制移植瘤的生長(zhǎng)和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移。該研究證實(shí)了EIF3B 在GC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著致癌作用，是GC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素，這可能有助于探索和發(fā)現(xiàn)GC 治療的新靶點(diǎn)。

4.4 hnRNPs 超家族蛋白

hnRNPs 超家族蛋白中的部分蛋白被鑒定為m6A 甲基化結(jié)合蛋白質(zhì)，它們的異常表達(dá)會(huì)影響mRNA 的穩(wěn)定性、翻譯、剪接以及腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移，但是目前其在GC 中的作用尚無(wú)大量的文獻(xiàn)報(bào)道。Chen 等[36]研究通過(guò)檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析GC 中hnRNPR 的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常組織相比，HnRNPR在GC 組織中顯著高表達(dá)。更重要的是，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：HnRNPR 在GC 組織中也顯著高表達(dá)，且hnRNPR 的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。CCNB1 是一種有絲分裂特異性因子，其與CDK1 形成復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2-M 的轉(zhuǎn)變；CENPF 是著絲粒家族的成員，其負(fù)責(zé)調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)hnRNPR 的表達(dá)與CCNB1、CENFP的表達(dá)呈正相關(guān)，hnRNPR 高表達(dá)可通過(guò)正反饋上調(diào)CCNB1 和CENPF 的表達(dá)，直接與CCNB1 和CENPF mRNA 相互作用調(diào)控GC 的細(xì)胞周期和腫瘤轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)GC 細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。該研究提示hnRNPR-CCNB1/CENPF軸可能是治療GC 患者的潛在靶點(diǎn)[36]。提示hnRNPA2B1 在各類GC 細(xì)胞中均過(guò)表達(dá)，而在胃腺黏液癌中hnRNPA2B1 擴(kuò)增最多，且hnRNPA2B1的過(guò)表達(dá)與低生存率相關(guān)。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hnRNPA2B1 通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)維持GC 的惡性表型。此外，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)BIRC5-202 是hnRNPA2B1 的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，hnRNPA2B1 可與幾個(gè)核心剪接體共同表達(dá)，調(diào)控抗凋亡因子BIRC5 的可變剪接,增加致癌亞型BIRC5-202 的表達(dá)，從而促進(jìn)GC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[37]。

目前的研究結(jié)果表明，m6A 甲基化在GC 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，未來(lái)可能會(huì)成為GC 治療的潛在藥物靶點(diǎn)，表1。

表1 GC 中m6A 調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)與功能

表1 GC 中m6A 調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)與功能（續(xù)表1）

5 m6A 與GC 化療耐藥

在腫瘤的治療過(guò)程中,化學(xué)藥物治療有著不可替代的作用。但是，由于許多遺傳和表觀遺傳信息的改變，化療耐藥仍然是惡性腫瘤治療失敗的最大原因。m6A 修飾相關(guān)蛋白在GC 化療耐藥中發(fā)揮重要的作用，有望成為GC 耐藥治療的新靶點(diǎn)。質(zhì)子泵抑制劑可能是一種較好的治療策略，可增加GC 細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。用奧美拉唑預(yù)處理可增強(qiáng)5-FU、DDP、TAX 對(duì)GC 細(xì)胞的抑制作用。Feng 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，用奧美拉唑預(yù)處理可誘導(dǎo)FTO 表達(dá)下調(diào)而提升細(xì)胞總m6A 水平。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)奧美拉唑誘導(dǎo)的FTO 抑制可增強(qiáng)激活mTORC1 信號(hào)通路，并抑制自噬，從而提高GC 細(xì)胞化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而提高療效。同時(shí)，經(jīng)奧美拉唑誘導(dǎo)的FTO 沉默通過(guò)依賴m6A 機(jī)制提高mTORC1 下游凋亡相關(guān)的腫瘤抑制基因DDIT3 的轉(zhuǎn)錄水平而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該研究提示m6A 修飾FTO 可能在GC 中提高質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑介導(dǎo)的化療敏感性。此外，一項(xiàng)Ⅱ期研究中，證實(shí)了依維莫司對(duì)以前治療過(guò)的晚期GC 患者顯示出了良好的療效。近期研究發(fā)現(xiàn)依維莫司可靶向干預(yù)GC 中METTL3/miR-17-92/TMEM127或PTEN/mTOR信號(hào)通路而提高化療敏感性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)METTL3 高表達(dá)的GC 對(duì)mTOR 抑制劑依維莫司表現(xiàn)出更高的敏感性，并且依維莫司可以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)METTL3 誘導(dǎo)的腫瘤增殖。該研究結(jié)果揭示了METTL3 水平可能是依維莫司治療GC 療效的潛在預(yù)測(cè)因子，也為依維莫司治療m6A/METTL3 水平較高的GC 提供了理論依據(jù)[12]。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，目前已證實(shí)m6A 甲基化修飾在GC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控GC 的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和調(diào)節(jié)化療耐藥性，并影響著GC 的預(yù)后。但目前m6A 甲基化相關(guān)蛋白在GC 中的研究仍較少，亟需更多大規(guī)模的臨床研究進(jìn)一步闡明m6A 甲基化修飾調(diào)控GC 及誘發(fā)GC 的分子機(jī)制，探索可能作為GC 早期診斷和治療的敏感性更高的m6A 甲基化標(biāo)志因子，將有助于為臨床GC 患者判斷預(yù)后及探索新的靶向治療創(chuàng)造更多的機(jī)遇。