韓肖華，陳潞婷,2，李娟，李丹萍，陳紅

許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病與不同類(lèi)型的神經(jīng)元損傷、減少、死亡有關(guān)。如阿爾茨海默病的認(rèn)知功能障礙與基底前腦的膽堿能神經(jīng)元有關(guān)[1]。隨著細(xì)胞分化技術(shù)的發(fā)展，人多潛能干細(xì)胞包括人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞已可以在體外被誘導(dǎo)分化為不同類(lèi)型的特定神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞移植治療提供很好的細(xì)胞來(lái)源[2]。

內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（medial ganglionic eminence，MGE）是胚胎發(fā)育時(shí)期腹側(cè)前腦的一個(gè)結(jié)構(gòu)，主要標(biāo)志物為NKX2.1。研究發(fā)現(xiàn)敲除NKX2.1基因可造成基底前腦的CHAT神經(jīng)元減少，進(jìn)而導(dǎo)致海馬θ節(jié)律的改變及學(xué)習(xí)記憶的嚴(yán)重缺失[3]。CHAT神經(jīng)元是與認(rèn)知功能息息相關(guān)的一類(lèi)神經(jīng)元，在體外分化主要來(lái)源于NKX2.1表達(dá)的MGE神經(jīng)前體細(xì)胞[4]。目前，MGE的體外分化主要可得到的神經(jīng)元類(lèi)型為GABA神經(jīng)元和CHAT神經(jīng)元，可以作為治療和改善學(xué)習(xí)記憶障礙相關(guān)疾病的細(xì)胞源。

本研究將對(duì)擬胚體（Embryo，EB）懸浮培養(yǎng)法和單層貼壁培養(yǎng)法這2種分化培養(yǎng)方案進(jìn)行對(duì)比研究，以期更經(jīng)濟(jì)、有效地誘導(dǎo)人多潛能干細(xì)胞分化獲得可供移植治療的MGE區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

人胚胎干細(xì)胞系（H9,P25-55）由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科干細(xì)胞研究中心提供（美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校張素春教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）。DMEM-F12培養(yǎng)基，N2、B27添加劑，Dispase，Accutase購(gòu)自Gibco公司；bFGF購(gòu)自R&D公司；DMH1，SB431542，SAG購(gòu)自Selleck公司；XAV939購(gòu)自Stemgent公司；BDNF，GDNF，IGF-1購(gòu)自Peprotech公司；cAMP，PLO，Triton-X100購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；Laminin購(gòu)自Invitrogen公司。驢血清購(gòu)自武漢飛羿科技公司；Rabbit anti-NKX2.1一抗（1∶200～1∶500）購(gòu)自Abcam公司；驢抗兔Alexa Fluor488（1∶500）購(gòu)自Proteintech公司；DAPI購(gòu)自Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 人多潛能干細(xì)胞單層貼壁誘導(dǎo)法培養(yǎng)分化 復(fù)蘇后的H9細(xì)胞于37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞克隆長(zhǎng)到整個(gè)孔的80%左右進(jìn)行傳代。加入含有SB431542（2μM），DMH1（2μM），XAV939（2μM）幾種小分子的神經(jīng)分化培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，按照1∶2或1∶3進(jìn)行傳代接種至MEF貼壁6孔板中進(jìn)行細(xì)胞分化。隔天換液，直至分化第7天。在此過(guò)程中，當(dāng)分化的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)神經(jīng)管狀結(jié)構(gòu)，并開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)上皮細(xì)胞典型的玫瑰花環(huán)狀后，加入含不同濃度的SAG（0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM）小分子誘導(dǎo)劑的神經(jīng)分化培養(yǎng)液繼續(xù)分化。隔天換液，直至分化第14天，當(dāng)幾乎所有的細(xì)胞團(tuán)已經(jīng)形成明顯的玫瑰花環(huán)狀結(jié)構(gòu)后，加入含B27和SAG小分子的神經(jīng)分化培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，接種到T25培養(yǎng)瓶中，移入37℃，CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。第2天若可以觀察到神經(jīng)球的出現(xiàn)，則隔天換液，直至第20天。然后將神經(jīng)球接種到PLO/Laminin包被過(guò)的24孔板中的玻片上，然后加入含有BDNF、GDNF、cAMP、IGF-1及SAG和B27等小分子添加物的神經(jīng)元培養(yǎng)液，隔3天換液，之后觀察神經(jīng)球逐漸發(fā)出神經(jīng)纖維，進(jìn)而逐漸成熟為神經(jīng)元。

1.2.2 人多潛能干細(xì)胞EB懸浮法培養(yǎng)分化 復(fù)蘇后的H9細(xì)胞，于37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞克隆長(zhǎng)到整個(gè)孔的80%左右進(jìn)行傳代。消化下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，至第2天即可觀察到EB球的形成，每天換液至第4天。更換神經(jīng)分化培養(yǎng)液，隔天換液至第7天。第7天將T25培養(yǎng)瓶中所有的EB球均勻鋪在6孔板里，5～8 h后，可以看到大部分EB球均已貼壁。隔天換液，至第10天。此過(guò)程中觀察到細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)了神經(jīng)管的形狀，繼而開(kāi)始出現(xiàn)玫瑰花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。再將培養(yǎng)基更換成含0.5μM SAG的神經(jīng)分化培養(yǎng)液，隔天換液，至第16天，在此階段可觀察到大部分細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)明顯玫瑰花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。再加入含B27和SAG小分子的神經(jīng)分化培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，接種T25培養(yǎng)瓶中，移入37℃，CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。次日即觀察到有神經(jīng)球的形成，隔天換液至第24天。后續(xù)分化方法同單層培養(yǎng)法。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光染色及計(jì)數(shù) 用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.2%Triton-X100+10%驢血清室溫下孵育1 h。加入Rabbit anti-NKX2.1（1∶200～1∶500）一抗在4℃下孵育，過(guò)夜。吸棄一抗工作液，加入驢抗兔Alexa Fluor488（1∶500）二抗室溫下孵育45 min，注意避光操作。加入DAPI核染10 min。甘油封片，奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察，選用200×或400×倍鏡下的視野拍照，用ImageJ軟件進(jìn)行免疫熒光染色細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組至少3張細(xì)胞玻片，每張玻片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每組數(shù)據(jù)至少有3次獨(dú)立重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩對(duì)比采用LSD或Dunnett T3檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種誘導(dǎo)方案不同分化階段的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)

在單層貼壁培養(yǎng)法中，分化早期加入TGF-β、BMP和WNT通路抑制劑SB431542、DMH1、XAV939等小分子促使人多潛能干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層發(fā)育，在分化第4天時(shí)可以觀察到神經(jīng)管的出現(xiàn)，在第7天時(shí)慢慢出現(xiàn)玫瑰花環(huán)狀的形態(tài)。此時(shí)再加入SAG小分子促使細(xì)胞向腹側(cè)發(fā)育，在第14天幾乎所有的細(xì)胞團(tuán)都呈現(xiàn)出典型的玫瑰花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將貼壁細(xì)胞懸浮成神經(jīng)球的狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的維持誘導(dǎo)發(fā)育。在21天神經(jīng)球貼壁后加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞成熟，貼壁后可以觀察到神經(jīng)細(xì)胞逐漸成熟，見(jiàn)圖1。

圖1 人多潛能干細(xì)胞單層誘導(dǎo)法分化

在EB培養(yǎng)法中，在第7天貼壁后，逐漸開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)管的形態(tài)。在第10天加入SAG小分子，至第16天時(shí)觀察到大部分的細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出玫瑰花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。之后在第25天時(shí)將貼壁細(xì)胞懸浮成神經(jīng)球狀態(tài)，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下逐漸分化為神經(jīng)元，見(jiàn)圖2。

圖2 人多潛能干細(xì)胞EB誘導(dǎo)法分化

2.2 不同濃度的SAG對(duì)MGE神經(jīng)前體細(xì)胞的影響

本研究在單層貼壁培養(yǎng)法中采用了不同濃度的SAG進(jìn)行誘導(dǎo)分化，獲得MGE前體細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，見(jiàn)圖3A。NKX2.1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，當(dāng)SAG濃度為0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM和3μM時(shí)，NKX2.1陽(yáng)性細(xì)胞率分別為0%、（48.3±11.5）%、（78.6±2.7）%、（77.6±4.0）%、（69.0±7.5）%和（67.7±7.9）%；SAG濃度為0.5μM和1μM時(shí)誘導(dǎo)分化獲得的MGE神經(jīng)前體細(xì)胞純度顯著高于其他濃度組（與0.1μMSAG相比，P＜0.001；與2μM和3μM相比，P＜0.05），但2個(gè)濃度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3B。當(dāng)SAG濃度為0.5μM時(shí)，在EB懸浮培養(yǎng)法中NKX2.1的陽(yáng)性細(xì)胞率為（74.8±6.5）%，與單層貼壁培養(yǎng)法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 在不同SAG濃度下MGE前體細(xì)胞標(biāo)志物NKX2.1的表達(dá)

3 討論

根據(jù)研究者的目的的不同，人多潛能干細(xì)胞分化的培養(yǎng)可以向不同方向進(jìn)行，包括不同胚層、不同部位、不同區(qū)域和不同種類(lèi)的各個(gè)類(lèi)型細(xì)胞。體外分化可以探討疾病的發(fā)病機(jī)理[5]，也可以得到需要的細(xì)胞類(lèi)型用于細(xì)胞移植治療[6,7]。本研究主要采用不同小分子的聯(lián)合誘導(dǎo)將人多潛能干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層、前腦神經(jīng)上皮細(xì)胞、腹側(cè)前腦的MGE區(qū)進(jìn)行分化，進(jìn)而可分化為特定的神經(jīng)元類(lèi)型，以備后續(xù)的細(xì)胞移植治療。

在采用單層貼壁培養(yǎng)法分化MGE細(xì)胞過(guò)程中，DMH1、SB431542、XAV939分別是BMP、TGF-β、WNT通路的抑制劑。Chambers S.M團(tuán)隊(duì)[8]研究顯示：?jiǎn)为?dú)使用Noggin與SB431542，人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)上皮細(xì)胞分化效率低于10%，但當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)，分化效率可以達(dá)到80%。Noggin作為肽類(lèi)小分子，作用不穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)室將BMP通道抑制劑換成了DMH1，并且發(fā)現(xiàn)DMH1（2μM）聯(lián)合SB431542（2μM）使用可以將分化效率提高到95%[9]。為了促使神經(jīng)上皮細(xì)胞向前腦方向分化，我們加入了WNT通路的抑制劑XAV939。關(guān)于腹側(cè)化誘導(dǎo)，SHH通路激動(dòng)劑SAG和Purmorphamine[4,10]這2種小分子化合物報(bào)道使用較多。在本實(shí)驗(yàn)研究中我們主要采用了SAG這種幾乎不產(chǎn)生毒性作用且腹側(cè)化強(qiáng)度較高的小分子。一些研究也使用SAG這種小分子進(jìn)行誘導(dǎo)分化[11,12]，但幾乎沒(méi)有研究明確指出MGE分化時(shí)適宜的SAG濃度，所以在不同的研究中研究者采用的濃度差別很大。因此，在實(shí)驗(yàn)中我們首先探索了SAG濃度對(duì)獲得MGE神經(jīng)前體細(xì)胞純度的影響，本研究在其他研究的基礎(chǔ)上對(duì)幾種不同濃度的SAG（0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM）進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)采用0.5μM和1.0μM濃度SAG的對(duì)得到高純度的MGE神經(jīng)前體細(xì)胞較為適宜，濃度過(guò)大或過(guò)小均會(huì)抑制MGE的分化效率，且為了節(jié)約試劑成本，我們?cè)诤竺娴姆只芯捎?.5μM的SAG濃度。

隨后，我們?cè)?.5μM的SAG濃度下對(duì)2種不同方案進(jìn)行比較。在單層培養(yǎng)法中NKX2.1的陽(yáng)性表達(dá)率為（78.6±2.7）%，在EB培養(yǎng)法中陽(yáng)性表達(dá)率為（74.8±6.5）%（P＞0.05），提示采用濃度為0.5μM的SAG，2種分化方案獲得的MGE神經(jīng)前體細(xì)胞的純度沒(méi)有顯著差異。EB誘導(dǎo)法分化神經(jīng)細(xì)胞在早期的研究中應(yīng)用較廣[13]，但其分化成熟周期比單層誘導(dǎo)法要長(zhǎng)[14]，且單層誘導(dǎo)法細(xì)胞分化的模式化更加穩(wěn)定，所以現(xiàn)在越來(lái)越多的研究?jī)A向這種能夠縮短分化周期且分化狀態(tài)較為穩(wěn)定的培養(yǎng)方法。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)采用單層誘導(dǎo)法觀察到神經(jīng)球和神經(jīng)元的時(shí)間點(diǎn)均要早于采用EB誘導(dǎo)法分化。有研究主張?jiān)诤茉缙诩尤敫箓?cè)化的信號(hào)通路SHH激動(dòng)劑，這樣在神經(jīng)上皮誘導(dǎo)階段就可以促進(jìn)腹側(cè)的模式化，但SHH通路因子對(duì)前腦發(fā)育抑制性作用較強(qiáng)[15]，如果過(guò)早加入SHH激動(dòng)劑，可能會(huì)對(duì)頭尾側(cè)的模式化發(fā)育影響較大，所以SHH激動(dòng)劑加入的時(shí)間也是有爭(zhēng)議的，部分研究建議在分化的6～18 d加入SHH激動(dòng)劑是比較合適的[16]。在我們的研究中，我們開(kāi)始加入SAG的時(shí)間是第7天，獲得了較好的分化結(jié)果。

綜上所述，本研究探索了人多潛能干細(xì)胞分化培養(yǎng)MGE神經(jīng)前體細(xì)胞的SAG的適宜濃度為0.5μM，獲得MGE神經(jīng)前體細(xì)胞純度可以高達(dá)到70%～80%左右。單層貼壁法和EB懸浮法對(duì)最終得到MGE神經(jīng)前體細(xì)胞的純度影響沒(méi)有差異，但單層法比EB法能夠更加快速得到目的細(xì)胞。因此本研究提示：采用單層誘導(dǎo)法，0.5μM的SAG可能是人多潛能干細(xì)胞分化培養(yǎng)MGE神經(jīng)前體細(xì)胞的更優(yōu)化方案，為后續(xù)的細(xì)胞移植治療退行性神經(jīng)疾病奠定了基礎(chǔ)。