趙文娜 楊春雪

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

松嫩鹽堿草地是世界三大蘇打草原鹽堿地之一。如今，鹽堿地面積正以每年1.4%的速度擴展，松嫩草地生態(tài)系統(tǒng)正逐步走向衰老[1]。隨著菌根技術(shù)作為生物技術(shù)應(yīng)用于鹽堿地修復(fù)中，探索叢枝菌根(AM)真菌的研究正在廣泛進行。AM真菌是土壤中重要的生物成員之一，是一種可以與植物形成共生結(jié)構(gòu)的功能性微生物[2]。它通過改善土壤結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)寄主植物的礦質(zhì)營養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)植物的生理生化指標(biāo)，從而促進寄主植物的生長，并且可以促進寄主植物在水分脅迫、溫度脅迫、鹽堿脅迫、重金屬脅迫生境下的生長[3-8]。對于AM真菌的研究是從20世紀(jì)70年代開始的，在AM真菌多樣性方面的研究已開展了大量的工作。目前全球已發(fā)現(xiàn)的通過形態(tài)學(xué)鑒定出的AM真菌種類約為300種[9]，而在分子生物學(xué)水平上，DAVISION et al.[10]以NS31-AM1引物區(qū)段為主，收集了已發(fā)表的所有AM真菌序列，在97%序列相似性水平上確定了356個AM真菌分子種，并以此建立了Maarj AM數(shù)據(jù)庫。在此數(shù)據(jù)庫中，王永明[11]選用中國AM真菌多樣性的數(shù)據(jù)，并補充了近年來已經(jīng)發(fā)表的該數(shù)據(jù)庫中未涉及的數(shù)據(jù)，建立了中國AM真菌多樣性的數(shù)據(jù)庫，共得到了145個分子虛擬種，隸屬于8科12屬。中國地域廣闊，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，決定了我國AM真菌的物種十分豐富的特征，而在鹽漬土中，AM真菌往往群落結(jié)構(gòu)獨特，很可能蘊藏著具有特殊功能尤其是抗逆性強的AM真菌種類[12-14]。

紫花地丁(Violaphilippica)是堇菜科堇菜屬多年生草本?；ㄗ陷郎虻仙畲悍登嘣?，在哈爾濱地區(qū)4月左右可見花朵，根系發(fā)達，綠期長，是早春耐陰型地被植物[15]。目前人們對于紫花地丁的生態(tài)適應(yīng)性及抗逆性的研究也越來越多，除了耐陰性[16]、抗旱性[17]、抗寒性[18]、耐踐踏[19]等，紫花地丁還可以在含鹽量3.6 g/kg的鹽堿土壤環(huán)境下正常生長，具有較強的耐鹽堿能力[20]。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，松嫩鹽堿草地有紫花地丁的自然分布，但是關(guān)于紫花地丁根圍AM真菌多樣性的研究卻鮮有報道，基于其藍紫花色在園林應(yīng)用中的價值及其自身強抗逆性，本試驗選取生長在松嫩鹽堿草地的野生紫花地丁為試驗材料，采用形態(tài)學(xué)鑒定法和高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法，在科學(xué)了解紫花地丁根圍AM真菌多樣性的基礎(chǔ)下，更加充分的了解AM真菌形態(tài)，以期結(jié)合AM真菌在植物抗逆性方面的研究，進一步豐富藍紫色花植物在鹽堿地的應(yīng)用，此外也為豐富鹽堿地AM真菌資源，進一步探索具有特殊功能的AM真菌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究樣品于2019年4月在黑龍江省肇東市周邊(松嫩鹽堿草地西南部)草地進行采集(46°2′29″～46°3′58.16″E，125°54′2″～125°54′40″N)。該地區(qū)處于半濕潤半干旱中溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，降水的季節(jié)性變化造成了土壤雨季脫鹽和旱季積鹽交替變化[21]。在該地區(qū)隨機選取9塊紫花地丁生長地作為取樣地，在每個取樣地隨機選取10株長勢相似的紫花地丁，去除表層枯草等雜物，在植株根圍向下挖取約10 cm深的紫花地丁[22]，收集其根圍土壤約1.5 kg，然后經(jīng)“四分法”，每塊樣地分別保留1 kg根際土壤，將9塊樣地的土樣及根系進行編號，帶回實驗室。樣品在實驗室于通風(fēng)避光處自然風(fēng)干，過20目篩子去除雜物，分別裝入已編號的密封袋中，于4 ℃密封保存。

1.2 AM真菌孢子的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從9份樣品中分別隨機選取50 g土壤，通過濕篩傾析-蔗糖離心法[23]從土壤中分離出孢子和部分雜質(zhì)，用蒸餾水將其分別沖洗于9個培養(yǎng)皿中，在雙管實體解剖鏡下將孢子挑出，分別置于含有蒸餾水的離心管中，用超聲波清洗儀將孢子清洗干凈后，在雙管實體解剖鏡下，挑取單個孢子于載玻片上，滴加乳酸后蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-DSX500)下記錄不同樣品中孢子的顏色、表面紋飾、連孢菌絲、孢子大小、孢壁層數(shù)及厚度等特征并拍照。再用Melzer’s試劑染色，觀察孢子的特異性反應(yīng)并拍照。孢子根據(jù)《菌根鑒定手冊》、國際叢枝菌根真菌保藏中心(INVAM)官網(wǎng)、波蘭農(nóng)業(yè)大學(xué)(http://www.zor.zut.edu.pl/)以及已發(fā)表的論文中的AM真菌資源進行種屬鑒定。

1.3 高通量測序

從9份樣品中分別隨機選取50 g土壤，然后將其混合成一個綜合樣品X，從樣品X中稱取50 g土壤，從樣品X中分別稱取約2 g土壤裝入6支1.5 mL離心管中(6個重復(fù))，分別標(biāo)號ZHDD1、ZHDD2、ZHDD3、ZHDD4、ZHDD5、ZHDD6。將該6支離心管低溫保存交由上海派森諾生物科技有限公司，提取各樣品的總DNA，同時采用Nanodrop對DNA進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。使用AM真菌特異性引物AMV4.5NF(5’-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3’) 和AMDGR(5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’)進行片段擴增(片段長度280 bp)。隨后通過擴增產(chǎn)物磁珠純化回收、擴增回收產(chǎn)物熒光定量(熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader(Bio Tek,FLx800))，采用Illumina MiSeq-PE250對樣本進行雙端測序。測序數(shù)據(jù)分析首先對高通量測序的原始數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進行初步篩查，對問題樣本進行重測、補測，去除barcode序列，按照QIIME2 Vsearch對樣本的原始數(shù)據(jù)進行去引物、拼接、質(zhì)量過濾、去質(zhì)量、去嵌合體，從而獲得高質(zhì)量序列，然后在97%相似度水平對高質(zhì)量序列聚類，形成OTU。最后去除OTU表格中的singletons OTUs(所有樣本中豐度為1的OTU)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)根據(jù)派森諾測序結(jié)果，結(jié)合Microsoft Excel和派森諾基因云(https://www.genescloud.cn)云圖匯功能進行部分圖形處理、分析和繪制。孢子圖片采用PS 2019進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花地丁根圍AM真菌形態(tài)學(xué)鑒定及分布

2.1.1 紫花地丁根圍AM真菌形態(tài)學(xué)鑒定

通過形態(tài)鑒定，共得到11屬30種AM真菌(圖1)。分別為球囊霉屬9種：凹坑球囊霉(Glomusmultiforum)、單孢球囊霉(Glomusmonosporum)、多梗球囊霉(Glomusmulticaule)、海得拉巴球囊霉(Glomushyderabadensis)、具皰球囊霉(Glomuspustulatum)、寬柄球囊霉(Glomusmagnicaule)、微叢球囊霉(Glomusmicroaggregatum)、象牙白球囊霉(Glomuseburneum)、長孢球囊霉(Glomusdolichosporum)；硬囊霉屬1種：彎絲硬囊霉(Sclerocystissinuosa)；無梗囊霉屬7種：波狀無梗囊霉(Acaulosporaundulata)、刺無梗囊霉(Acaulosporaspinosa)、多果無梗囊霉(Acaulosporamyriocarpa)、格但無梗囊霉(Acaulosporagedanensis)、孔窩無梗囊霉(Acaulosporafoveata)、疏線無梗囊霉(Acaulosporapaulinae)、雙網(wǎng)無梗囊霉(Acaulosporabireticulata)；雙型囊霉屬2種：詹氏雙型囊霉(Ambisporajimgerdemannii)、薄壁雙型囊霉(Ambisporaleptoticha)；根孢囊霉屬(Rhizophgus)2種：根內(nèi)根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)、明根孢囊霉(Rhizophagusclarus)；隔球囊霉屬(Septoglomus)2種：沙荒隔球囊霉(Septoglomusdeserticola)、縮隔球囊霉(Septoglomusconstrictum)；斗管囊霉屬(Funneliformis)1種：摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)；盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)2種：圓齒盾巨孢囊霉(Scutellosporacrenulata)、黑盾巨孢囊霉(Scutellosporanigra)；近明球囊霉屬2種：幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)、近明球囊霉(Claroideoglomusclaroideum)；內(nèi)養(yǎng)囊霉屬(Entrophospora)1種：波羅的海內(nèi)養(yǎng)囊霉(Entrophosporabaltica)；巨孢囊霉屬(Gigaspora)1種：易誤巨孢囊霉(Gigasporadecipiens)。

圖1 松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌形態(tài)鑒定

2.1.2 紫花地丁根圍AM真菌分布

松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍不同采樣地土壤中AM真菌分布如表1所示，不同的AM真菌在不同土樣中的分布是不同的。在紫花地丁根圍土壤中，薄壁雙型囊霉、彎絲硬囊霉、沙荒隔球囊霉、縮隔球囊霉、幼套近明球囊霉、近明球囊霉較為常見。而具皰球囊霉、海得拉巴球囊霉、雙網(wǎng)無梗囊霉、波羅的海內(nèi)養(yǎng)囊霉分別僅在2、8、7、6號樣品中發(fā)現(xiàn)。

表1 松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌分布

續(xù)(表1)

2.2 高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

通過高通量測序，對松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌群落進行了系統(tǒng)性的分析，從紫花地丁根圍土壤中平均獲得有效序列74 718條，高質(zhì)量序列65 068條，去除所有樣本中豐度為1的OTU平均獲得65 000條序列。共獲得OTU數(shù)1 273個(表2)。物種累計曲線用于衡量和預(yù)測群落中物種豐富度隨樣本量擴大而增加的幅度，被廣泛應(yīng)用于判斷樣本量是否足夠并估計群落豐富度[24]。由圖2可知，隨著樣本量的增加，此時群落中的OTU總數(shù)將不再隨著新樣本的加入而顯著增加，曲線趨于平緩，表明樣本量已足以反映松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌群落的物種組成。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計

圖2 紫花地丁根圍AM 真菌物種累積曲線

2.3 高通量測序物種組成

2.3.1 AM真菌屬水平的相對豐度

通過將所得到的OTUs的代表序列與Maarj AM數(shù)據(jù)庫進行對比，從而對結(jié)果進行物種注釋。從屬水平上看(表3)，去除未注釋到屬的結(jié)果：未注釋Archaeosporales, 未注釋Gigasporaceae, 未注釋Glomerales, 未注釋Glomeromycetes, 未注釋Glomeromycota。從紫花地丁根圍土壤中共檢測并注釋到球囊霉屬，近明球囊霉屬、類球囊霉屬(Paraglomus)、多樣孢囊霉屬(Diversispora)、無梗囊霉屬、雙型囊霉屬和盾巨孢囊霉屬7個屬。其中球囊霉屬相對豐度最高，平均相對豐度為92%，其次為類球囊霉屬和近明球囊霉屬，其平均相對豐度分別為3%和2%，豐度值最低的為盾巨孢囊霉屬。本研究中球囊霉屬的平均相對豐度遠高于其他6個屬，為松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌優(yōu)勢屬。

表3 紫花地丁根圍AM真菌屬水平相對豐度

2.3.2 AM真菌物種的相對豐度

通過對測序結(jié)果進行物種注釋，鑒定到明確物種信息的有103種，分屬于7屬。其中球囊霉屬鑒定出82種，近明球囊霉屬鑒定出10種，類球囊霉屬鑒定出5種，多樣孢囊霉屬鑒定出3種，雙型囊霉屬、盾巨孢囊霉屬，無梗囊霉屬各一種。圖3可以明顯看出，在紫花地丁根圍土壤中Glomussp. VTX00202、Glomussp. VTX00222、Glomussp. VTX00304、Glomussp. VTX00172、Glomussp. VTX00419的豐度水平相對較高，Glomussp.VTX00222和Glomussp. VTX00202在紫花地丁根圍土壤AM真菌群落中所占豐度比例最大，遠高于其他種，其中Glomussp. VTX00222相對豐度為19.2%，為紫花地丁根圍土壤中的AM真菌優(yōu)勢種。

圖3 紫花地丁根圍AM真菌物種的相對豐度分析

2.3.3 AM真菌的α多樣性指數(shù)

α多樣性是指局部均勻生境下的物種豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標(biāo)。本研究以Chao1指數(shù)表征豐富度，以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性，以Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度，以Good’s coverage指數(shù)表征覆蓋度。紫花地丁根圍AM真菌的Chao1指數(shù)在855.317～931.122，Simpson指數(shù)在0.959 55～0.965 031，Shannon指數(shù)在5.672 41～5.726 42，Pielou’s evenness指數(shù)在0.603 710～0.624 549，Good’s coverage指數(shù)在0.995 834～0.996 308(表4)。

表4 紫花地丁根圍AM真菌的α多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗采用形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序技術(shù)結(jié)合的方法，對松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍土壤中AM真菌多樣性進行調(diào)查分析。通過形態(tài)學(xué)鑒定共得到11屬30種AM真菌。由于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果容易丟失不產(chǎn)生孢子的種類，并且部分孢子的形態(tài)很相似，很難客觀全面的對AM真菌作出評價[25]。為了提高形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的科學(xué)性，本試驗進一步通過高通量測序技術(shù)進行紫花地丁根圍土壤AM真菌多樣性的分析，共發(fā)現(xiàn)7屬103種VT，球囊霉屬為該地區(qū)紫花地丁根圍土壤AM真菌優(yōu)勢屬，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，其中Glomussp. VTX00222為松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍土壤的優(yōu)勢菌種。將以上研究結(jié)果與前人松嫩鹽堿草地研究[26-31]結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)：球囊霉屬均為該地區(qū)相關(guān)研究的優(yōu)勢屬，其中，大果球囊霉(Glomusmacrocarpum)、蔭性球囊霉(Glomustenebrosum)、刺球囊霉(Glomusspinosum)、微刺球囊霉(Glomusspinuliferum)、紅色盾巨孢囊霉(Scutellosporaerythropa)5種只在旋覆花根圍發(fā)現(xiàn)；何氏球囊霉(Glomushoi)、聚叢根孢囊霉(Rhizophagusaggregatus)、黏質(zhì)隔球囊霉(Glomusviscosum)、膨脹無梗囊霉(Acaulosporadilatata)、凹坑無梗囊霉(Acaulosporaexcavata)、多產(chǎn)雙型囊霉(Ambisporafecundispora)、盾狀盾巨孢囊霉(Scutellosporascutata)共7種只在星星草根圍發(fā)現(xiàn)；Diversisporatortuosa、Funneliformiscoronatus、德里球囊霉(Glomusdelhiense)、加拿大球囊霉(Glomuscanadense)、閃亮和平囊霉(Pacisporascintillans)、透光根孢囊霉(Rhizophagusdiaphanus)、懸鉤子硬囊霉(Sclerocystisrubiformis)、異配齒盾囊霉(Dentiscutataheterogama)、疣突斗管囊霉(Funneliformisverruculosum)9種僅在馬藺根圍發(fā)現(xiàn)；黃孢球囊霉(Glomusflavisporum)、團集球囊霉(Glomusglomerulatum)、暈環(huán)球囊霉(Glomushalonatum)、Acaulosporasporocapia、Septoglomusconstrictum共5種僅在鵝絨委陵菜根圍發(fā)現(xiàn)，然而，多梗球囊霉、象牙白球囊霉、波狀無梗囊霉、多果無梗囊霉、疏線無梗囊霉5種首次在該地區(qū)紫花地丁根圍AM真菌研究中被發(fā)現(xiàn)。此外，在該地區(qū)26種植物(包括旋覆花、星星草、馬藺、蒲公英、鵝絨委陵菜)研究中，縮隔球囊霉、根內(nèi)根孢囊霉兩種在該6個研究中均被發(fā)現(xiàn)，摩西斗管囊霉、凹坑球囊霉、膨果球囊霉(Glomuspansihalos)、沃克近明球囊霉(Claroideoglomuswalkeri)、長孢球囊霉、光壁無梗囊霉(Acaulosporalaevis)、孔窩無梗囊霉、薄壁雙型囊霉、彎絲硬囊霉、明根孢囊霉10種在大多數(shù)植物根圍被發(fā)現(xiàn)。造成該部分差異的原因分析：植物物種多樣性、基因型多樣性、功能群多樣性等都對AM真菌多樣性有一定的影響[32]。分析兩種鑒定方法，形態(tài)學(xué)鑒定具有不一致性、局限性和偶然性[33]，并且要求鑒定者對于已發(fā)現(xiàn)的AM真菌形態(tài)熟悉程度較高，因此，采用此方法很可能會低估該地區(qū)AM真菌多樣性。而高通量測序技術(shù)相對形態(tài)學(xué)鑒定方法具有較高的準(zhǔn)確性，但其也存在一定的局限性，采用高通量測序技術(shù)，由于微生物種類繁多，而目前的數(shù)據(jù)庫中微生物序列還無法完全覆蓋測序序列，或是參考序列缺少準(zhǔn)確的物種信息，導(dǎo)致一些具體的種、屬之間無法鑒別分開，從而導(dǎo)致一部分特征序列無法獲得種屬注釋，并且在分析過程中，一些豐度值非常低的種類可能被遺漏掉。通過將兩種方法結(jié)合起來，可以幫助更全面的發(fā)現(xiàn)AM真菌，從而提高試驗的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

鹽堿地是一類特殊的土地資源，而在此類特殊生境內(nèi)，可能蘊藏著具有特殊功能的AM真菌。早在2002年，王發(fā)園等[34]對黃河三角洲鹽堿地AM真菌多樣性進行研究，共獲得32種AM真菌，分屬于無梗囊霉屬、原囊霉屬(Archaeospora)、球囊霉屬，后在2016年王艷云等[35]對黃河三角洲鹽堿地AM真菌多樣性的調(diào)查中，又發(fā)現(xiàn)了類球囊霉屬、巨孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、多樣孢囊霉屬、斗管囊霉屬、近明球囊霉屬6屬AM真菌的存在，其中球囊霉屬為黃河三角洲鹽堿地AM真菌優(yōu)勢屬。在甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古鹽堿土AM真菌研究中，共得到球囊霉屬20種，多樣孢囊霉屬2種，原囊霉屬2種，無梗囊霉屬4種，其中根內(nèi)根孢囊霉和薄壁雙型囊霉為該地區(qū)鹽堿土中AM真菌優(yōu)勢種。而遠觀全球鹽堿土中AM真菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬、巨孢囊霉屬、斗管囊霉屬、近明球囊霉屬、無梗囊霉屬、內(nèi)養(yǎng)囊霉屬、根孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、多樣孢囊霉屬、硬囊霉屬在鹽堿土中均被檢測到,這與本研究結(jié)果表現(xiàn)一致，而在其中優(yōu)勢種的分析中，各個地區(qū)研究的結(jié)果是不同的，但大都屬于球囊霉屬，也有部分研究中的優(yōu)勢AM真菌種屬于根孢囊霉屬、無梗囊霉屬[36-38]。因此我們可以思考球囊霉屬、類球囊霉屬、近明球囊霉屬、多樣孢囊霉屬、無梗囊霉屬、雙型囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、斗管囊霉屬、近明球囊霉屬等在鹽堿地常被檢測到的AM真菌屬是否對于鹽堿生境有著不同程度的適應(yīng)性，尤其是球囊霉屬在鹽堿生境中的重要地位，這也是我們需要進一步探索的問題。此外，因AM真菌受寄主植物的影響，一些AM真菌物種主要在深層土中形成孢子，而一些常在表土層形成孢子[39]。由于不同植物根系生長范圍不同，我們需研究不同植物根圍土壤AM真菌種類，發(fā)現(xiàn)更多AM真菌，豐富鹽堿地AM真菌資源，為進一步發(fā)現(xiàn)耐鹽性AM真菌種類提供一定的理論基礎(chǔ)。