卓婭·買買提烏斯?jié)M 向紅 白雪 李楊靜 王紅梅

衰弱是一種臨床上可識別的狀態(tài)，隨著年齡增長的同時，個體對應(yīng)激事件的易感性隨之增加，導(dǎo)致系統(tǒng)功能和生理儲備功能顯著下降[1]。目前，衰弱的生物學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚，但已有研究表明，衰弱與遺傳因素相關(guān)[2]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，個體DNA甲基化與年齡有關(guān)，它可以作為衰老以及個體衰弱的生物學(xué)標(biāo)志物[3]。雖然DNA甲基化的相關(guān)研究已在心血管系統(tǒng)疾病、PD、DM以及各系統(tǒng)腫瘤等多種疾病的發(fā)病機制研究中廣泛應(yīng)用，但目前國內(nèi)外有關(guān)DNA甲基化與衰弱的研究很少見，有關(guān)NF-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)基因甲基化與衰弱的研究則更為少見。本研究旨在通過病例對照研究來分析RANK基因甲基化與新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱的相關(guān)性,以期從表觀遺傳學(xué)角度探討我國老年人衰弱的可能機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究是以自然人群橫斷面流行病學(xué)調(diào)查為基礎(chǔ)的病例-對照研究。采用多級隨機抽樣的方法對2018年4～5月新疆農(nóng)牧區(qū)65歲以上男性常住居民進行現(xiàn)況調(diào)查：第一階段隨機選取南疆和北疆各1個縣(北疆木壘縣和南疆洛浦縣)；第二階段在每個縣隨機抽取6個鄉(xiāng)；第三階段在每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機抽取5個村；第四階段在每個村隨機抽取35人進行問卷調(diào)查。調(diào)查前先行人口登記，確?；貜?fù)率以及研究對象之間相互無關(guān)聯(lián)。問卷調(diào)查由我科住院醫(yī)師(研究生學(xué)歷)經(jīng)過培訓(xùn)后填寫。最后，從中隨機抽樣90例，其中哈薩克族30例，維吾爾族28例，漢族32例。

1.2 研究方法

1.2.1 衰弱評估：采用Fried衰弱表型評估研究對象是否衰弱：(1)行走步速減慢；(2)握力減低；(3)不明原因體質(zhì)量減輕；(4)自感疲乏無力；(5)體力活動減少。符合上述任意3項或以上者定義為衰弱；滿足任意1～2項者為衰弱前期；無上述表現(xiàn)者為無衰弱。本研究將衰弱者作為病例組，衰弱前期及無衰弱者作為對照組。

1.2.2 臨床資料收集：收集研究對象的基本資料，包括年齡、血壓、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓史、DM病史等。研究對象空腹6～8 h后，采集外周血5 mL，離心分離后的血清由我院檢驗科完成ALT、AST、肌酐(Cr)等生化指標(biāo)檢測，余下的血液有形成分于-80 ℃條件下保存，用于提取DNA。

1.2.3 基因組DNA提取以及RANK基因甲基化檢測：外周血細胞基因組DNA提取完全按照德國PAXgene Blood DNA kit試劑盒所提供的操作步驟進行。使用Methyl Primer Express v1.0系統(tǒng)設(shè)計引物：上游引物為5′-GGTGCCTTTCTAGAATTTGGTGG-3′，下游引物為5′-CCAACCCTAAATTACCCTTCAC-3′，PCR產(chǎn)物長度為376 bp，CpG位點共20個[4]。采用EpiTect快速亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(德國)對基因組甲基化進行修飾。修飾后反復(fù)洗脫和純化并置于-20 ℃環(huán)境中保存。選用上述質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)的DNA再行PCR擴增并回收產(chǎn)物，由上海生工生物工程有限公司對回收PCR擴增產(chǎn)物進行測序。采用BiQ Analyzer軟件對比分析RANK基因組的標(biāo)準(zhǔn)序列以及測序序列。

2 結(jié)果

2.1 新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性的臨床特征 哈薩克族、漢族、維吾爾族的病例組與對照組的各項臨床特征及生化指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性的臨床特征比較

2.2 不同民族病例組與對照組RANK基因甲基化率比較 不同民族病例組與對照組組內(nèi)的RANK基因CpG島甲基化率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3個民族的對照組RANK基因CpG島甲基化率均明顯高于病例組(P<0.05)。見表2。

表2 不同民族病例組與對照組RANK基因甲基化率比較

2.3 新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱與校正后的RANK基因甲基化率的相關(guān)性分析 在校正年齡、吸煙、飲酒、BMI，及高血壓、糖尿病患病率后，協(xié)方差分析結(jié)果依然顯示，新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱者的RANK基因CpG島甲基化率顯著低于非衰弱者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

表3 新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱與校正后的RANK基因甲基化率的相關(guān)性分析

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳機制研究的重要內(nèi)容之一，同時它也是可逆的DNA自然化學(xué)修飾方式，參與相關(guān)基因的表達調(diào)控[5-6]。有研究表明，在不同種族人群中，DNA甲基化水平也不一定相同：西班牙裔美國人以及白種人的OPRM1基因甲基化水平明顯低于非洲裔美國人[7]；非洲裔女性P16INK4基因甲基化率明顯低于白人女性[8]。因此，本研究先對不同民族間的RANK基因甲基化率的差異進行分析，結(jié)果顯示，新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性的RANK基因CpG島甲基化率之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DNA甲基化水平易受到年齡、飲食、葉酸水平、社會經(jīng)濟地位等多種因素的影響，而居住地、飲食習(xí)慣、毒品和藥物濫用以及不同生活方式等都可以極大地影響遺傳同質(zhì)群體的甲基化水平[9]。本研究所選的研究對象均為新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性自然人群，他們的居住環(huán)境、飲食習(xí)慣頗為相似，因此，不同民族對RANK基因甲基化率的影響較小。

有報道顯示，衰弱人群的DNA甲基化水平較非衰弱人群低[10]，且衰弱進展程度與顯著降低的甲基化水平有關(guān)[11]。也有研究提示，衰弱者的低甲基化可能與增齡情況下DNA復(fù)制后再甲基化受阻有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性衰弱者的RANK基因CpG島甲基化率均顯著低于非衰弱者，且校正BMI、飲酒、吸煙、年齡、高血壓、糖尿病等協(xié)變量后，依然得出新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱者的RANK基因CpG島甲基化率顯著低于非衰弱者，提示RANK基因甲基化率降低與衰弱可能相關(guān)。

本研究仍存在不足之處：首先本研究為橫斷面研究，只能研究其相關(guān)性；其次，本研究樣本量較少，未來需要進一步的大樣本驗證以確保重復(fù)性。