侯 偉，張蕾萍，王繼芬，魏春明，盧 亮，仲利靜，劉浩田

（1.中國人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

氯胺酮（Ketamine，KET）自20 世紀60 年代發(fā)現(xiàn)以來，在較長一段時間內(nèi)作為一種麻醉藥物被廣泛用于人類和動物醫(yī)學(xué)中，同時由于其止痛作用，小劑量氯胺酮也被應(yīng)用于治療急慢性疼痛和抑郁癥［1－2］。氯胺酮作用于人體后會起到分離麻醉效用，產(chǎn)生一種與環(huán)境和自身分離的感覺［3］，這種特殊的麻醉效果導(dǎo)致使用者對其產(chǎn)生依賴性，進而逐步發(fā)展成為世界范圍內(nèi)濫用最嚴重的毒品種類之一。氯胺酮可在人體肝臟中進行細胞色素P450亞型代謝，在代謝過程中，氯胺酮在酶的作用下發(fā)生去甲基化反應(yīng)生成去甲氯胺酮（Norketamine，NK），再進一步羥基化形成羥基去甲氯胺酮（Droxynorketamine，HNK）［4］。在Ⅱ相代謝過程中，羥基去甲氯胺酮進一步與葡萄糖醛酸結(jié)合，之后由腎臟排出［5］。

目前，國內(nèi)外對于氯胺酮和去甲氯胺酮的研究較為豐富，通常采用氣相色譜法和高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法等對生物體液中的氯胺酮及其代謝物進行檢驗［6－8］，但血液、尿液等生物體液樣本的檢測時效較短，不易采集和保存，難以反映受試者在數(shù)周乃至數(shù)月內(nèi)的吸毒情況。另外，較少有對生物檢材中的氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮同時進行檢驗分析的研究，目前僅Lisa等［9］和Hasan等［10］開展了人體血液中3 種物質(zhì)同時檢驗的研究，對于毛發(fā)檢驗領(lǐng)域的此類研究相對匱乏。而作為一種新型生物檢材，毛發(fā)具有其他生物檢材所不具備的特殊優(yōu)勢，如易于采集和保存、不易摻假、檢測周期長、吸毒信息反映全面等［11－12］，自公安部2018年頒布《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測規(guī)范》［13］后，毛發(fā)檢驗在法庭科學(xué)檢驗領(lǐng)域的作用愈發(fā)關(guān)鍵，正逐步成為公安機關(guān)打擊和監(jiān)督毒品犯罪的重要依托，因此開展毛發(fā)樣本中氯胺酮及其代謝物的研究具有非常重要的理論和實踐意義。

基于此，本研究建立了一種高動能研磨結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）檢驗毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的方法，優(yōu)化了毛發(fā)的清洗和提取過程，同時采用建立的方法檢測毛發(fā)樣本，得到人體毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量數(shù)據(jù)，并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析處理，研究吸食者毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物的含量分布規(guī)律，為基層公安處理相關(guān)涉毒案件提供理論支撐與方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Shimadzu 30A UPLC超高效液相色譜儀、AUW120D電子天平（日本島津公司）；Q－TRAP 5500串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB Sciex 公司）；純水儀（美國Millipore 公司）；臺式高速冷凍離心機（i國Sigma 公司）；球磨儀（北京萬孚智能科技有限公司）；HGC－12型氮吹儀（美國PerkinElmer公司）。

1 mg/mL 的氯胺酮（KET）、去甲氯胺酮（NK）和羥基去甲氯胺酮（HNK）標準品均購于美國Supelco 公司；用甲醇稀釋后得到0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、100 ng/mL 3種物質(zhì)的混合標準溶液。

甲酸、甲酸銨（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；丙酮、正己烷、二氯甲烷、鹽酸、十二烷基硫酸鈉、四硼酸鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

準確稱取0.2 g 十二烷基硫酸鈉固體加入100 mL 純水中制得0.1%十二烷基硫酸鈉溶液；向49 mL甲醇中加入1 mL鹽酸制得2%的酸性甲醇試劑；稱取0.382 g四硼酸鈉固體加入100 mL純水中制得硼砂緩沖液（pH 9.0）。

毛發(fā)樣本采集自浙江和云南近3 個月以來吸食過氯胺酮的志愿者，所有志愿者進行毛發(fā)樣本采集前均已簽訂知情同意書。采集方法為用干凈剪刀從靠近頭皮的后枕部頂點處剪下一綹頭發(fā)，使用錫箔紙包裹以防止靜電，置于紙質(zhì)信封中并標明采集者信息和毛發(fā)生長方向。收集頭發(fā)樣本后，記錄每名志愿者的相關(guān)信息，包括姓名、性別、年齡、吸毒史和頭發(fā)燙染情況等?？瞻最^發(fā)樣本取自無藥物使用史的受試者后枕部頭發(fā)。所有樣品均在室溫下保存于樣品袋中，待分析。

1.2 樣品前處理

準確稱取50 mg頭發(fā)樣品于15 mL離心管中，分別加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉水溶液、5 mL超純水和5 mL 丙酮，每種試劑各洗滌2 次，每次清洗1 min。收集最后一次洗滌溶劑氮氣吹干并用1 mL甲醇復(fù)溶，待UPLC－MS/MS檢測。

將洗凈的頭發(fā)從離心管中取出，置于通風(fēng)櫥中晾干。用剪刀將頭發(fā)剪成2～3 mm 左右小段，準確稱取20 mg 頭發(fā)并置于專用研磨管內(nèi)，再加入1 mL 甲醇，振蕩混勻。使用球磨儀以3 000 r/min 研磨3 min，超聲處理2 h，取500 μL 研磨液于離心管中，以4 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 有機膜過濾，待UPLC－MS/MS分析。

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 選用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。流動相：A 為含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨水溶液，B 為甲醇，流速0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min，5%B；1.0～1.1 min，5%～20%B；1.1～3.0 min，20%～70%B；3.0～4.0 min，70%～95%B；4.0～6.0 min，95%B；6.0～6.1 min，95%～5%B；6.1～7.0 min，5%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正離子掃描模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）；離子源電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）壓力：35 MPa；霧化氣（GS1）壓力：55 MPa；輔助氣（GS2）壓力：60 MPa。氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of ketamine，norketamine and hydroxynorketamine

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了甲醇、乙腈和0.1%甲酸乙腈為有機流動相時對3種待測物峰形的影響。結(jié)果顯示：以0.1%甲酸乙腈為有機流動相時，氯胺酮和去甲氯胺酮的色譜峰峰形較差，并產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象；以乙腈為有機流動相時，3種待測物的響應(yīng)較低，且羥基去甲氯胺酮的峰形較差，因此實驗最終選擇使用甲醇為有機流動相，并與含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨水溶液組成流動相進行后續(xù)實驗。優(yōu)化色譜條件下的氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮（質(zhì)量濃度均為2 ng/mL）的總離子流圖見圖1，3個化合物的分離良好，峰形尖銳對稱。

圖1 氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的總離子流圖（2 ng/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of ketamine，norketamine and hydroxynorketamine（2 ng/mL）

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 清洗程序的選擇 毛發(fā)的清洗程序是前處理過程的重要環(huán)節(jié)，能夠清除毛發(fā)表面的污漬，避免其它雜質(zhì)干擾檢測結(jié)果，然而滲透性過強的試劑在清洗過程中可能會造成待測物流失，因此清洗試劑的選擇非常重要。實驗考察了6 種清洗方式對毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮檢出效果的影響：不進行清洗處理（a），其余清洗程序均在超純水清洗后，換用丙酮（b）、甲醇（c）、二氯甲烷（d）、0.1%十二烷基硫酸鈉和丙酮（e）、丙酮和正己烷的混合溶液（體積比1∶1，f）各清洗2 次，每次1 min，所有試劑單次用量均為5 mL。將真實毛發(fā)樣本平均分成18 份，每份50 mg，分別使用以上6 種清洗方式處理，每種方法平行3 次，按“1.2”方法處理并檢測，取3 組平行樣本的平均值為該方法下的標準值，最終得到6 種清洗程序后的真實毛發(fā)樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的檢出效果差異見圖2。

圖2 不同清洗方法對氯胺酮及其代謝物的檢出效果影響Fig.2 Effects of different cleaning methods on the extraction of ketamine and its metabolites

由圖可見，不同清洗方法會影響氯胺酮及其代謝物的檢測結(jié)果，特別對于氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的影響較為明顯。經(jīng)過清洗處理后的毛發(fā)，氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的檢出效果均優(yōu)于未清洗的毛發(fā)，表明適當清洗可清除雜質(zhì)而不造成此兩種物質(zhì)的過量損失，其中方法e 清洗后對氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的檢出效果最佳，且去甲氯胺酮的效果相對較好，而經(jīng)方法d處理后的效果最差，毛發(fā)中去甲氯胺酮的檢出量甚至低于未經(jīng)處理的樣本，這可能是由于二氯甲烷在清洗過程中能夠滲透進入毛發(fā)內(nèi)部，使得其中部分去甲氯胺酮溶解在清洗液中，從而降低了去甲氯胺酮的檢出量。綜上，最佳清洗方法選擇5 mL 的0.1%十二烷基硫酸鈉溶液、超純水和丙酮各清洗2 次，每次1 min。

2.2.2 提取程序的考察 考察了5種提取方法對毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物檢出效果的影響：①將干凈毛發(fā)置于1 mol/L NaOH 溶液中，75 ℃水浴15 min，使用乙酸乙酯進行液－液萃取，萃取液在35 ℃氮氣流下吹干并用初始流動相復(fù)溶，進樣分析；②向裝有干凈毛發(fā)的離心管中加入1 mL甲醇直接超聲2 h，離心過濾后進樣分析；③向裝有干凈毛發(fā)的離心管中加入1 mL 甲醇并使用毛發(fā)研磨儀研磨，再超聲2 h，離心過濾后進樣分析；④向裝有干凈毛發(fā)的離心管中加入1 mL酸化甲醇（10 mL甲醇中含20 μL純鹽酸）進行研磨，超聲2 h，離心過濾后進樣分析；⑤加入1～2 mL 硼砂緩沖液（pH 9.0）并研磨，超聲2 h，使用乙酸乙酯進行液－液萃取，萃取液在35 ℃溫和氮氣流下吹干并用初始流動相復(fù)溶，進樣分析。將清洗完成后的毛發(fā)分為15份，每份20 mg，置于15 mL離心管中，分別使用上述5種方法進行提取處理，每種方法平行測試3 次，最終得到每種提取方法下真實毛發(fā)樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的響應(yīng)值。以每種提取方法下3組平行樣本的平均值為其標準值，最終得到5種提取方法下3種物質(zhì)的檢出效果差異。

結(jié)果顯示，在氯胺酮及其代謝物的提取過程中，使用堿消解和甲醇研磨超聲輔助提取的效果最好，這是由于堿性溶液和研磨時高速粒子撞擊使得毛發(fā)破碎較為完全，毛發(fā)中的物質(zhì)得以充分釋放；使用硼砂緩沖液進行提取的效果相對稍差，可能是因為萃取過程造成了待測物的損失；使用酸化甲醇研磨和甲醇超聲的效果最差，這是由于氯胺酮及其代謝物屬于偏堿性物質(zhì)，使用酸化甲醇難以在短時間內(nèi)進行有效提取，而直接進行甲醇超聲無法破壞毛發(fā)的基本結(jié)構(gòu)，因而難以將待測物充分釋放。與甲醇研磨超聲輔助提取法相比，堿消解雖然能夠?qū)⒚l(fā)破壞得更徹底，但存在基質(zhì)效應(yīng)高、操作復(fù)雜等缺點，同時在萃取過程中會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，影響實驗結(jié)果的準確性。綜合考慮，選擇甲醇研磨超聲輔助提取作為毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物的最佳提取方法。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 工作曲線、檢出限與定量下限 稱取干凈空白毛發(fā)8份，每份20 mg，分別置于8支研磨管中，使用移液槍向其中分別添加1 mL不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、100 ng/mL）的氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的混合標準溶液并用氮氣吹干，制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5 ng/mg 的系列加標樣品，按“1.2”方法處理，進樣檢測后繪制氯胺酮及其代謝物的工作曲線（x為待測物濃度，y為對應(yīng)峰面積），以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限（LOD），以S/N=10計算定量下限（LOQ），結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：3 種化合物在0.01～5 ng/mg 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均不低于0.996 2，LOD為0.005～0.020 ng/mg，LOQ為0.01～0.05 ng/mg。

表2 3個化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of 3 compounds

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)、回收率與精密度 稱取清洗后的空白毛發(fā)9 份，每份20 mg，分別置于9 支研磨管中，向其中分別添加1 mL 不同質(zhì)量濃度（1、10、100 ng/mL）氯胺酮及其代謝物的混合標準溶液并在穩(wěn)定氮氣流下緩慢吹干，制成3 種物質(zhì)含量為0.05、0.50、5.00 ng/mg 的毛發(fā)陽性樣本，每個樣本平行3 組，在優(yōu)化條件下處理并測定，計算方法的回收率和基質(zhì)效應(yīng)［14］。制備同樣濃度梯度樣品在同一天內(nèi)的早、中、晚3 個不同時間檢測，計算氯胺酮及其代謝物峰面積的日內(nèi)精密度（RSD）；連續(xù)測定3 d，計算日間RSD。結(jié)果顯示：氯胺酮及其代謝物在優(yōu)化條件下的回收率為86.7%～106%，基質(zhì)效應(yīng)為88.1%～99.6%，日內(nèi)RSD 為0.72%～4.1%，日間RSD 為1.9%～6.3%（表3），表明方法的準確性及精密度良好，完全滿足毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物的檢驗要求。

表3 3個化合物的回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度（n=3）Table 3 Recoveries，matrix effects and precisions（n=3）of 3 compounds

2.4 毛發(fā)陽性樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

實驗收集了50 份氯胺酮吸食者毛發(fā)樣本，其中男性樣本38 份，占樣本總數(shù)的76%，女性樣本12份，占樣本總數(shù)的24%，采用建立的UPLC－MS/MS方法分析，結(jié)果見表4。

表4 毛發(fā)陽性樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量Table 4 Content distribution of KET，NK and HNK in the positive hair samples

由表4 可見，50 份真實毛發(fā)樣本中均檢出氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮，含量分別為0.30～73.80 ng/mg（均值為8.84 ng/mg）、0.04～5.98 ng/mg（均值為1.05 ng/mg）和0.30～58.90 ng/mg（均值為8.91 ng/mg），其各自的分布情況如圖3所示，其中橫線及數(shù)字表示平均含量。

圖3 毛發(fā)陽性樣本中氯胺酮（A）、去甲氯胺酮（B）和羥基去甲氯胺酮（C）的含量分布情況Fig.3 Content distributions of ketamine（A），norketamine（B）and hydroxynorketamine（C）in the positive hair samples

由圖可知，去甲氯胺酮的含量范圍較窄，分布較為集中；而氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量范圍較寬，整體呈現(xiàn)非正態(tài)分布，少部分毛發(fā)樣本具有較高含量，從而明顯拉高了含量均值，因此需采用分段統(tǒng)計的方法進一步分析。根據(jù)Musshoff 等［15］的分析方法，可將3 種物質(zhì)的含量經(jīng)由低到高的順序排序后再按照百分位分段，各百分位的值和其他相關(guān)數(shù)據(jù)如表5所示。

表5 3個化合物的百分位值（p）、平均值、標準偏差（SD）、最小值和最大值Table 5 Percentile values（p）for 3 compounds，average，standard deviation（SD）and minimum and maximum values（ng/mg）

根據(jù)表5 中百分位分段統(tǒng)計可知，50 份真實毛發(fā)樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的平均含量均高于（50%），分布明顯偏斜。超過90%的樣本中氯胺酮的含量不高于20 ng/mg，其中超過半數(shù)樣本含量位于1～10 ng/mg 范圍內(nèi)，另外僅有不到10%樣本中氯胺酮含量高于20 ng/mg，且分布較為分散；去甲氯胺酮在毛發(fā)中的含量低于氯胺酮且分布相對集中，標準偏差為1.33 ng/mg，近75%樣本中去甲氯胺酮的含量低于1 ng/mg；羥基去甲氯胺酮在毛發(fā)中的含量分布與氯胺酮相似，多數(shù)樣本含量低于20 ng/mg。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結(jié)合向平等［16］的分段統(tǒng)計方法，可將毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物的含量大致分為低、中、高3個層次，相關(guān)數(shù)據(jù)見表6，其中氯胺酮和羥基去甲氯胺酮均以1 ng/mg和10 ng/mg為劃分節(jié)點，去甲氯胺酮則以0.2 ng/mg 和1 ng/mg 為劃分節(jié)點。由于分段標準的差異會影響最終結(jié)果，本劃分方法僅做參考。

表6 3個化合物在不同層次下的含量范圍、平均值、樣本數(shù)及所占比例Table 6 Content ranges，average values，sample numbers and proportions of 3 compounds at different levels

采用數(shù)據(jù)分析軟件IBM SPSS Statistics 26 對50 份真實毛發(fā)樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量進行相關(guān)性檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去甲氯胺酮和氯胺酮、羥基去甲氯胺酮和氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮含量之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient）分別為0.871、0.945 和0.913，表明三者間呈正相關(guān)，且相關(guān)性較為顯著。其中羥基去甲氯胺酮與氯胺酮含量之間的相關(guān)性相對較高，由表4 數(shù)據(jù)可知兩者間的含量比率均在1.00 上下浮動，表明兩者在毛發(fā)中的含量較為相似；去甲氯胺酮與氯胺酮之間的含量比率在0.05～0.60之間，這與Salomone等［17］將兩者間的最小濃度比設(shè)定為0.05這一研究結(jié)論較為契合。

由于個體在服用劑量、自身代謝、頭發(fā)顏色、吸毒習(xí)慣等方面的差異，吸毒人員毛發(fā)中的氯胺酮及其代謝物的含量不盡相同，因此目前國內(nèi)外對于毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物的陽性認定閾值尚存在一定爭議。本研究中50 份真實毛發(fā)樣本中氯胺酮的最低含量為0.30 ng/mg，高于國際毛發(fā)分析協(xié)會（The society of hair testing，SOHT）和國內(nèi)相關(guān)技術(shù)規(guī)范所建議的0.20 ng/mg 的陽性閾值，但低于Leung 等［18］和歐洲工作場所藥物測試協(xié)會（European workplace drug testing society，EWDTS）［19］所建議的0.40 ng/mg 和0.50 ng/mg 的陽性閾值。本研究的含量數(shù)據(jù)可為氯胺酮及其代謝物的陽性閾值提供一定參考，但由于樣本數(shù)量不足，尚難以提出確切的閾值建議。然而相關(guān)研究表明，堿性藥物進入人體后，其中所含陽離子基團會與黑色素的羧基之間產(chǎn)生靜電吸引作用，從而促進藥物與毛發(fā)的結(jié)合，毛發(fā)中黑色素的含量越高，結(jié)合藥物的能力越強［20］。根據(jù)該理論，中國人頭發(fā)中的黑色素較國外部分人群更為豐富，相同條件下氯胺酮及其代謝物更容易與之結(jié)合并沉積，因此研究認為氯胺酮及其代謝物的陽性閾值應(yīng)不低于國外相關(guān)權(quán)威標準，即不低于0.20 ng/mg。此外，由于毛發(fā)處理過程中可能會存在一定污染而造成假陽性結(jié)果，因此還需參考毛發(fā)中原藥與代謝物的含量比率等數(shù)據(jù)來最終認定是否為陽性。

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢驗毛發(fā)中氯胺酮及其代謝物去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的分析方法，并考察和優(yōu)化了毛發(fā)的清洗程序，該方法簡單、易于操作、回收率高、重現(xiàn)性好，能夠滿足基層公安對于毛發(fā)檢材的檢驗要求。應(yīng)用該方法檢驗了50份毛發(fā)樣本，并對氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮在陽性毛發(fā)中的含量數(shù)據(jù)進行分段統(tǒng)計，獲取了氯胺酮及其代謝物在不同含量區(qū)間的數(shù)據(jù)分布情況，初步分析了氯胺酮原藥及其代謝物的含量關(guān)系和陽性閾值，該數(shù)據(jù)可為涉毒案件的辦理以及后續(xù)研究吸毒人員毛發(fā)中的毒品含量提供借鑒和依據(jù)。