許曉輝，王小喬，董 蔚，吳福祥，杜銳滸，朱仁愿，石曉峰

（1. 蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 蘭州 730050；2. 甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；3. 蘭州中檢科測(cè)試技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730070）

雞內(nèi)金是一種動(dòng)物源性中藥材，也是藥食同源的中藥之一，其來(lái)源為雉科動(dòng)物家雞Gallus gallusdomesticus Brisson 的干燥沙囊內(nèi)壁［1］，具有健胃消食、澀精止遺、通淋化石等作用，主要用于治療積滯（食積、石積、酒積和瘀血）、消渴、瘡瘍、遺尿等［2］。由于家雞在飼養(yǎng)中使用飼料添加劑、抗生素等，嚴(yán)重影響了雞內(nèi)金的質(zhì)量。其中化學(xué)合成的磺胺類藥物因具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌性能高效、價(jià)格低廉、使用簡(jiǎn)單、供應(yīng)充足等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖業(yè)，而含有該類藥物的動(dòng)物產(chǎn)品一旦被人長(zhǎng)期攝入，會(huì)在人體內(nèi)不斷蓄積，產(chǎn)生腎毒性、耐藥性及過(guò)敏反應(yīng)，也可引起白細(xì)胞減少癥和破壞胃腸道微生物平衡等［3－4］。為此我國(guó)發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》（GB31650－2019）中明確規(guī)定了動(dòng)物產(chǎn)品中磺胺類藥物的總殘留量最高為100 μg/kg［5］。

有關(guān)動(dòng)物性食品中磺胺類藥物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、放射免疫法、免疫傳感器法和酶聯(lián)免疫法等，樣品前處理方法有液液萃取等傳統(tǒng)方法和固相萃取法、固相微萃取法以及基質(zhì)固相分散法等新方法［6－12］，這些檢測(cè)方法和樣品前處理手段各具優(yōu)勢(shì)和缺陷。QuEChERS是一種廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)的前處理技術(shù)，具有準(zhǔn)確度高、樣品制備時(shí)間短、分析速度快、溶劑用量小和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。目前，已有QuEChERS/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中磺胺類藥物殘留的報(bào)道［13－16］，但有關(guān)雞內(nèi)金中磺胺類藥物的檢測(cè)方法尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。為了評(píng)估雞內(nèi)金中磺胺類獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)，本研究采用QuEChERS 法提取雞內(nèi)金樣品，以PRiME HLB 固相萃取柱凈化提取液，基于超高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）技術(shù)，建立了雞內(nèi)金中磺胺甲噁唑等9種磺胺類藥物的檢測(cè)方法，并用于實(shí)際樣品的快速篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290－6460 超高效液相色譜－三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（美國(guó)安捷倫有限公司）；MS105DU 分析天平（美國(guó)梅特勒公司）；Vortex－genie2 渦旋混合器（美國(guó)Scientific 公司）；5810R 離心機(jī)（i國(guó)Eppendorf 公司）；SBL－10DT 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

對(duì)照品：磺胺甲噁唑（純度99.5%，下同）、磺胺氯噠嗪（99.1%）、磺胺喹沙啉（98.9%）、磺胺甲基嘧啶（99.1%）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（99.1%）、磺胺間二甲氧嘧啶（99.5%）購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司，磺胺二甲嘧啶（100%）、磺胺嘧啶（99.7%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，磺胺間甲氧嘧啶（99.1%）購(gòu)于Bepure公司。

乙腈、甲醇（色譜純，i國(guó)Merck 公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；其它試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水；PRiME HLB固相萃取柱（6 mL/500 mg，美國(guó)沃特世公司）。

實(shí)際檢測(cè)雞內(nèi)金樣品均隨機(jī)購(gòu)于蘭州市中藥材市場(chǎng)和藥店。

1.2 溶液配制

1.2.1 EDTA 緩沖液 稱取檸檬酸8.4 g、磷酸氫二鈉7.1 g、乙二胺四乙酸二鈉19.5 g，溶于650 mL水中，超聲溶解即得。

1.2.2 混合對(duì)照品溶液 精密稱取9種磺胺類藥物對(duì)照品各10.0 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL 的各磺胺類藥物單一對(duì)照品溶液；分別精密吸取上述單一對(duì)照品溶液0.025 mL，置于同一25 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成各藥物質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的混合對(duì)照品中間液；最后精密移取該混合對(duì)照品中間液1.00 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成各藥物質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃冷藏備用。

1.3 樣品處理

1.3.1 試樣制備 殺雞后取出雞肫，立即剝下內(nèi)壁洗凈，置于炒制容器用文火加熱至鼓起的程度，取出放涼即得。稱取干燥的空白或供試品雞內(nèi)金，分別粉碎過(guò)20目篩，備用。

1.3.2 提取與凈化 準(zhǔn)確稱取干燥的雞內(nèi)金樣品2.0 g 于50 mL 離心管中，加入3 mL EDTA 緩沖液，放入陶瓷均質(zhì)子，渦旋混合1 min 后，加入10 mL 乙腈，渦旋混合1 min，在300 W 功率下超聲提取5 min，加入1 g氯化鈉和4 g硫酸鈉，充分渦旋混合2 min，以5 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液過(guò)PRiME HLB 固相萃取柱，保持1 滴/s 的流速，收集凈化流出液，過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜，作為供試品溶液；取空白樣品同法制成空白基質(zhì)樣品溶液；然后分別將供試品溶液和空白基質(zhì)樣品溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待分析。

1.4 UPLC－MS/MS分析

1.4.1 UPLC 條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A 為含0.1%甲酸和2 mmol/L 乙酸銨的水溶液，B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～2 min，15% B；2～3 min，15%～25% B；3～4 min，25%～35% B；4～5 min，35%～50% B；5～9 min，50%～90%B；9～11 min，90%～15%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（d－MRM），霧化氣（N2）流速為8 L/min，噴霧電壓為500 V，氣流溫度為325 ℃，毛細(xì)管電壓為4 000 V，鞘氣流速為12 L/min，鞘氣溫度為350 ℃?；前奉愃幬锏馁|(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 9種磺胺類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of nine kinds of sulfonamides

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

本研究的9 種磺胺類藥物能夠較好地溶解于甲醇和乙腈中，而乙腈為中等極性溶劑，與大多數(shù)待測(cè)化合物的極性接近，且能使蛋白質(zhì)變性沉淀；另外，雞內(nèi)金中含有大量的蛋白質(zhì)，可借助QuEChERS 萃取鹽包（鹽包內(nèi)含4 g硫酸鈉和1 g氯化鈉）通過(guò)鹽析使樣品中蛋白質(zhì)沉淀并通過(guò)離心去除，因此選擇QuEChERS 法提取樣品。在此基礎(chǔ)上，選擇PRiME HLB 固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，可有效吸附去除雞內(nèi)金提取液中的磷脂等非極性干擾物，降低基質(zhì)效應(yīng)以增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)，同時(shí)該凈化方法無(wú)活化、清洗和洗脫等傳統(tǒng)固相萃取步驟，直接上樣凈化，簡(jiǎn)化了流程，節(jié)約了時(shí)間。實(shí)驗(yàn)還考察了提取過(guò)程加EDTA 與未加EDTA 的提取效果（見(jiàn)圖1），結(jié)果顯示加EDTA 提取可顯著提高大部分磺胺類藥物的回收率。優(yōu)化的樣品前處理?xiàng)l件如“1.3.2”所示。

圖1 加入與未加EDTA緩沖液的提取結(jié)果對(duì)比Fig.1 Comparison of extraction results with and without EDTA buffer

2.2 色譜條件的優(yōu)化

磺胺類藥物大多數(shù)偏極性，因此實(shí)驗(yàn)選擇適用于極性化合物的通用ACQUITY BEH C18超高效色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。正離子模式下，在流動(dòng)相中添加甲酸能夠提高目標(biāo)化合物的離子化效率，添加乙酸銨能夠穩(wěn)定水相和改善峰形，實(shí)驗(yàn)考察了乙腈－水、甲醇－水中添加不同量的甲酸和乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)9 種磺胺類藥物的分離效果和靈敏度。結(jié)果表明，在水相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨可顯著改善峰形、提高靈敏度，在有機(jī)相中加入0.1%甲酸可穩(wěn)定保留時(shí)間、提高重復(fù)性。優(yōu)化的色譜分析條件如“1.4.1”所示。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將9 種磺胺類藥物單一對(duì)照品溶液直接注入質(zhì)譜儀，在正離子模式下進(jìn)行全掃描（Scan）以確定母離子；進(jìn)行選擇離子掃描（SIM）確定碎裂電壓；然后進(jìn)行子離子掃描，選取豐度比最高且相對(duì)穩(wěn)定的2 個(gè)碎片離子分別作為定性離子和定量離子；最后利用MassHunter 采集軟件，以手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式同時(shí)優(yōu)化定性和定量離子的碰撞能量，建立多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方法，并在MRM 方法下分析混合對(duì)照品溶液，再將采集的數(shù)據(jù)文件從安捷倫的MassHunter質(zhì)譜采集工作站軟件導(dǎo)入自動(dòng)生成d－MRM方法。d－MRM 方法包含化合物名稱、MRM 離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量、動(dòng)態(tài)MRM 的保留時(shí)間和保留時(shí)間增量窗口，對(duì)于軟件不能自動(dòng)識(shí)別保留時(shí)間及保留時(shí)間增量窗口的化合物，可用安捷倫定性軟件通過(guò)提取化合物的離子對(duì)手動(dòng)識(shí)別。優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件如“1.4.2”所示。

以d－MRM 模式測(cè)定9種磺胺類藥物的定性和定量離子對(duì)色譜圖，共有18個(gè)離子監(jiān)測(cè)通道?；旌蠈?duì)照品溶液（20 ng/mL）的總離子流圖如圖2所示，各目標(biāo)化合物的峰形對(duì)稱、響應(yīng)良好、定量準(zhǔn)確可靠。

圖2 9種磺胺類藥物對(duì)照品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of nine kinds of sulfonamides standards

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

為明確雞內(nèi)金中9 種磺胺類藥物檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME），通過(guò)考察質(zhì)量濃度為5 ng/mL 的各對(duì)照品溶液在空白樣品基質(zhì)與純?nèi)軇┲行盘?hào)強(qiáng)度的比值百分比評(píng)價(jià)ME，比值百分比越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)越?。槐戎蛋俜直却笥?00%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；比值百分比小于100%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示：磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶的ME比值百分比均大于70%，表明存在弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)；磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶的ME 比值百分比為60%～70%，表明存在中等的基質(zhì)抑制效應(yīng)。雖然9種磺胺類藥物存在較弱或中等的基質(zhì)抑制效應(yīng)，但不影響分析檢測(cè)結(jié)果。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限 精密移取混合對(duì)照品溶液適量，用空白樣品基質(zhì)溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、20、30、40、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法定量，以各化合物的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積的積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，9種磺胺類藥物在0～50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0.996 0。將混合對(duì)照品溶液加入空白基質(zhì)中，加標(biāo)濃度逐級(jí)遞減，按“1.3.2”進(jìn)行樣品前處理，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算定量下限（LOQ），并計(jì)算LOQ濃度水平的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，9種磺胺類藥物的LOD為0.065 4～0.715 7 μg/kg，LOQ為0.212 2～2.478 μg/kg，LOQ濃度水平的回收率為63.1%～70.5%，RSD為2.8%～6.2%（見(jiàn)表2）。

表2 9種磺胺類藥物的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relationships，LODs and LOQs of nine kinds of sulfonamides

2.5.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 在空白雞內(nèi)金樣品中分別按15.0、25.0、50.0 μg/kg 3個(gè)濃度添加混合對(duì)照品中間液，每個(gè)加標(biāo)水平平行制備6 份樣品，經(jīng)提取凈化后上機(jī)測(cè)定，每份樣品重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果表明，9 種磺胺類藥物的回收率為63.2%～88.7%，RSD（n=6）為0.90% ～7.1%（見(jiàn)表3）。

表3 9種磺胺類藥物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of nine kinds of sulfonamides（n=6）

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法篩查10 批雞內(nèi)金樣品中9 種磺胺類藥物殘留，結(jié)果在1 份樣品中檢出磺胺甲噁唑，含量為0.88 μg/kg，其MRM 圖如圖3 所示。由于目前尚無(wú)動(dòng)物源性中藥中獸藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)，參照現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB31650－2019進(jìn)行判定，該陽(yáng)性樣品的磺胺甲噁唑殘留量未超標(biāo)。

圖3 磺胺甲噁唑陽(yáng)性樣品的MRM圖Fig.3 MRM spectra of sulfamethoxazole for positive sample

3 結(jié) 論

本研究以QuEChERS法進(jìn)行提取，PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，采用UPLC－MS/MS技術(shù)建立了藥食同源中藥雞內(nèi)金中9 種磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法。該方法具有前處理步驟簡(jiǎn)單，凈化效果顯著，準(zhǔn)確性好，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，適用于雞內(nèi)金中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)，可為降低藥食同源中藥的安全風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支持。