劉 寒，戴遠興，呂明芳，袁正杰，李 靜，嚴成其，張恒木，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021)

自然界中植物常受到多種病原菌的侵害，在與病原菌的長期斗爭過程中，植物進化出了獨特的免疫系統(tǒng)。一方面，植物通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原模式分子(pathogen-or micro-derived molecular patterns，PAMP或MAMP)，激發(fā)PAMP免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)反應，啟動抗性相關基因表達，阻止病原菌侵染；另一方面，病原體通過釋放效應子(effector)減弱植物PTI反應，植物R蛋白識別效應子，啟動免疫反應(effector-triggered immunity，ETI)[1-2]，激活防御信號，使信號從病原感染部位傳導至未感染部位，產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。水楊酸(salicylic acid，SA)是PTI和ETI過程中激活SAR的重要信號分子，大量研究發(fā)現(xiàn)，外源SA處理能提高植物抵抗生物和非生物逆境脅迫[3-4]。

植物體內SA存在2種生物合成途徑：一是異分支酸(ICS)途徑，為擬南芥合成SA的主要途徑；二是苯丙氨酸(PAL)途徑，為水稻合成SA的主要途徑[5-6]。健康擬南芥和本氏煙中SA含量均較低，每g鮮重中通常含0.03～1.00 μg SA[7-13]。擬南芥和本氏煙對外源SA敏感，0.1～1.0 mmol·L-1外源SA即可穩(wěn)定誘導其防衛(wèi)基因的表達，增強其對真菌、細菌、病毒等病原菌的抗性[14-17]。單子葉模式植物水稻SA含量較高，每g鮮重通常含SA 8～37 μg[18-19]，推測水稻對外源SA的敏感性可能與雙子葉植物不同。不同學者曾采用0.01～400 mmol·L-1外源SA處理水稻[20-25]，但由于濃度跨度大，測試的基因不一致，難以總結出SA對水稻的生物效應，給SA的生產(chǎn)應用造成困擾。水稻苗期是水稻生長發(fā)育過程中對許多病原體和非生物逆境脅迫的敏感期，在此發(fā)育階段誘導抗性對水稻穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。SA是誘導植物抗性的重要信號分子，然而，其處理水稻苗的最適濃度及其對水稻苗期生長、防衛(wèi)相關基因表達的影響還不清楚。為了分析外源SA對水稻苗期生長和防衛(wèi)相關基因表達的影響，本研究通過梯度濃度SA處理苗期水稻，并采用分光光度計、qRT-PCR等方法分析了水稻苗期生長、抗性相關基因表達水平與外源SA濃度的關系，為SA應用和深入研究功能機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的水稻品種均為日本晴(Nipponbare)，由本實驗室繁種保存。水楊酸(SA，貨號為69-72-7)、丙酮等生化試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol購于上海Thermo Fisher Scientific公司；反轉錄與定量試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 水稻栽培與SA處理

將日本晴水稻種子經(jīng)75%乙醇和2%次氯酸鈉除菌后[26]，置于浸潤的濾紙上，37 ℃催芽48 h后用水稻全營養(yǎng)培養(yǎng)液[27]培養(yǎng)，于28 ℃、12 h/12 h(L/D)條件下培養(yǎng)；期間每2 d換1次新鮮的水稻營養(yǎng)液，培養(yǎng)2周，達2葉1心或3葉1心期(多種病原敏感期)后，利用帶有刻度的噴壺分別加入梯度濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol·L-1SA，充分噴施水稻苗期植株(每株2.0 mL)，對照為1.6%乙醇。由于SA處理能快速誘導植物防衛(wèi)反應，因此本研究采集SA處理0、2、4、8、12、24、48 h樣品，樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取和定量分析

采用Trizol試劑，參照項聰英等[28]的方法提取水稻樣品總RNA；采用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(上海翊圣生物科技有限公司)試劑合成cDNA，方法參照試劑盒說明書；采用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)(上海翊圣生物科技有限公司)試劑在熒光定量PCR儀7900HT(Thermo Fisher)上進行定量分析，反應條件設置為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每組實驗設置3個生物學重復和3個技術重復，定量基因引物信息見表1。

表1 qPCR采用的引物

1.4 水稻葉綠素含量分析

取新鮮水稻苗葉片0.5 g，加入2.0 mL抽提液(乙醇、丙酮、H2O體積比為4.5∶4.5∶1.0)進行抽提，每組實驗設置3個生物學重復和3個技術重復。以抽提液為空白對照，使用多功能酶標儀Spect-raMax?M5(美國Molecular Devices公司)在波長645 nm和663 nm處測定葉綠素提取物吸光度，然后參照修正后的Arnon法公式計算葉綠素含量[30]。

2 結果與分析

2.1 外源SA處理對水稻苗期生長的影響

葉綠素含量是反映水稻苗生長狀況的重要參數(shù)之一，采用分光光度計分析SA對水稻苗葉綠素含量的影響，結果如圖1-A所示。低濃度SA(≤2.0 mmol·L-1)處理，不影響水稻葉綠素含量，其中，1.0～2.0 mmol·L-1SA處理的水稻苗葉綠素含量在一定時間內略微上升；中濃度SA(4.0 mmol·L-1)處理后，水稻苗葉綠素含量在24 h后開始下降，在48 h后下降顯著(P<0.05)；而高濃度SA(>4.0 mmol·L-1)處理24 h后水稻苗葉綠素顯著(P<0.05)下降。進一步觀察表型發(fā)現(xiàn)，高濃度SA(>4.0 mmol·L-1)處理對水稻生長影響較大，8.0、16.0 mmol·L-1SA處理24 h后水稻莖桿外周的葉鞘開始褪綠(圖1-B)；隨著處理時間的延長，褪綠區(qū)域逐漸擴大(圖1-C)；處理72 h后，褪綠區(qū)域嚴重黃(白)化，葉片出現(xiàn)萎蔫(圖1-D)；處理72 h后，4.0 mmol·L-1SA處理的水稻苗莖桿外周葉鞘也出現(xiàn)褪綠。表明高濃度SA處理可能通過抑制苗期葉綠素積累影響水稻苗生長。

2.2 外源SA處理對SA自身合成的影響

植物體內SA存在ICS (isochorismate synthase)和PAL (phenylalanine ammonia lyase)合成途徑，在水稻中PAL途徑占主導地位[31-32]。為了探究外源SA處理對水稻中SA合成的影響，選取水稻PAL途徑的關鍵基因OsPAL1進行定量分析。結果(圖2)顯示，低濃度SA(0.1～4.0 mmol·L-1)處理，OsPAL1基因在8 h內表達量顯著下調(約50%)，12 h后其表達量呈逐步恢復趨勢，與對照相比，其表達量恢復至80%以上，表明低濃度SA處理對OsPAL1表達影響較小。高濃度SA(尤其是8.0～16.0 mmol·L-1)處理水稻后，OsPAL1基因表達顯著下調(80%～90%)。上述結果表明，外源噴施SA可下調OsPAL1基因表達，其下調幅度與外源SA濃度呈正相關，推測高濃度外源SA可能抑制水稻內源SA的生物合成。

2.3 外源SA對水稻SA受體基因表達的影響

NPR類基因編碼SA受體蛋白，其中，NPR1是關鍵基因[33-34]。因此，定量分析NPR1基因的表達量來研究外源SA對水稻SA受體基因表達的影響。結果(圖3)顯示，外源SA處理后水稻NPR1基因表達顯著上調，在處理24 h時NPR1基因表達量達到最高，提升10～20倍，其中，2.0 mmol·L-1SA處理水稻苗24 h后，NPR1表達量最高。

2.4 外源SA對水稻W(wǎng)RKY基因表達的影響

WRKY類轉錄因子與SA誘導的抗性密切相關，SA顯著誘導WRKY轉錄因子家族成員的表達，調控SA信號途徑下游基因的表達[35-37]。本研究選取OsWRKY45、OsWRKY76來分析SA對水稻苗WRKY基因表達的影響，結果見圖4。其中，OsWRKY45對SA處理的響應較慢，在處理早期(2 h)其表達量幾乎不受影響；當SA濃度低于1.0 mmol·L-1時，在12 h內，OsWRKY45表達量變化的幅度較小；處理24～48 h時，OsWRKY45表達量顯著上升，其中1.0～4.0 mmol·L-1SA處理的OsWRKY45表達量較高，與對照相比上調8倍以上。SA濃度超過1.0 mmol·L-1時，OsWRKY76的響應較快，與對照相比，在2 h之內上調2倍以上；隨著處理時間的延長，OsWRKY76的表達量穩(wěn)步上升，在24～48 h，OsWRKY76的表達量最高達4倍以上(圖4-B)。

2.5 外源SA對病程相關蛋白基因的影響

病程相關蛋白基因(PR基因)是一類重要的防衛(wèi)基因，且參與MAPK調節(jié)植物穩(wěn)態(tài)的過程，大量的研究表明，SA可影響PR基因的表達[38-40]。由圖5可知，0.1～16.0 mmol·L-1SA處理的水稻苗中OsPR1a表達量均上調，隨著處理時間的延長，OsPR1a表達量也逐漸升高，處理24 h達到最高。其中，1.0～2.0 mmol·L-1SA對OsPR1a的誘導效應最大；OsPR1b變化趨勢與OsPR1a不同，低濃度(尤其是0.1 mmol·L-1)SA使OsPR1b的表達上調，而較高濃度SA(>1.0 mmol·L-1)處理時則顯著抑制OsPR1b的表達。

3 討論

SA可通過調節(jié)植物基因表達水平參與植物生長發(fā)育、抵抗逆境脅迫[41]。本研究選取的6個基因均屬于SA生物合成或其抗性信號傳導途徑的關鍵基因，結果均表明外源SA能影響這些基因的表達，影響效果與外源SA濃度密切相關，反映了外源SA濃度的重要性。在擬南芥和本氏煙等雙子葉模式植物中通常采用的外源SA濃度為0.1～1.0 mmol·L-1[13-14]；在水稻中，不同學者采用外源SA濃度差異較大[20-22，24-25，35，37]，這給處理效果的比較與實驗重復造成諸多不便。SA在水中的溶解度較低，難以用水溶液配制高于16.0 mmol·L-1的SA，若要配制更高濃度的SA需加有機溶劑(如乙醇)，而過多的有機溶劑會給植物造成新的逆境脅迫[42]；因此，本研究未采用16～400 mmol·L-1SA處理，采用0.1～16.0 mmol·L-1SA。2.0 mmol·L-1SA不僅能顯著誘導防衛(wèi)反應信號通路(NPR1、WRKY45、WRKY76、PR1a)基因的表達，且對葉綠素含量、SA合成產(chǎn)生的影響較小，這為后續(xù)外源SA處理提供了實驗依據(jù)。8.0 mmol·L-1以上SA能夠顯著誘導防衛(wèi)反應信號通路基因(NPR1、WRKY45、WRKY76、PR1a)的表達，但明顯抑制水稻苗期葉綠素的積累，處理24 h后甚至可觀察到葉片褪綠、黃化、萎蔫等癥狀；但Xie等[25]采用400 mmol·L-1處理水稻，卻未見其報道如此高濃度的SA對水稻生長產(chǎn)生不利影響，其原因尚有待進一步探究。有研究顯示，高濃度SA降低小麥、擬南芥葉綠素含量，低濃度SA促進葉綠素積累[6]。與此相似，本研究中1.0～2.0 mmol·L-1SA處理48 h，水稻苗葉綠素含量升高，高濃度SA(>4.0 mmol·L-1)處理，會抑制葉綠素的合成。綜合分析顯示，2.0 mmol·L-1外源SA處理苗期水稻較為合適，在實際使用時可根據(jù)其內源SA含量適當調整外源SA濃度，避免盲目使用造成人力物力浪費。