姬凱元， 邱月陽(yáng)， 程 敖， 蔣書(shū)東， 彭夢(mèng)玲

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 安徽省畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

犬細(xì)小病毒(Canineparvovirus，CPV)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)，細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)，原細(xì)小病毒屬(Protoparvovirus)[1]，可引起犬急性出血性腸炎和幼犬心肌炎。雖然CPV是DNA病毒，但其顯示出與RNA病毒相似的高突變率，VP2基因每年每個(gè)位點(diǎn)的替換量約為10-4[2]。自1978年在美國(guó)首次報(bào)道原始CPV-2亞型以來(lái)，在世界范圍內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)CPV-2a[3]、CPV-2b[4]、CPV-2c[5]、New-CPV-2a[6]、New-CPV-2b[7]、CPV-2c(a)[6]和CPV-2c(b)[6]等8種亞型。

CPV是一種沒(méi)有包膜結(jié)構(gòu)的單股線狀DNA病毒，基因組全長(zhǎng)5.3 kb，包括兩個(gè)主要開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)[1]。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1 和 NS2)，其中，NS1是一種多效性核磷蛋白，主要誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞凋亡，對(duì)于病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制至關(guān)重要[8]；ORF2主要編碼衣殼蛋白(VP1和VP2)，VP2作為主要的結(jié)構(gòu)蛋白，決定CPV的組織嗜性和宿主范圍[9]；兩側(cè)為非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)流行株主要以New-CPV-2a、New-CPV-2b和CPV-2c為主[10-12]。為了解近年安徽地區(qū)CPV的遺傳變異情況，本研究通過(guò)采集2018—2019年安徽地區(qū)動(dòng)物醫(yī)院疑似犬細(xì)小病毒感染犬糞便或肛門(mén)拭子，提取的DNA進(jìn)行鑒定并隨機(jī)選取10株進(jìn)行全基因組序列分析，了解安徽地區(qū)犬細(xì)小病毒主要亞型和遺傳變異情況，期望為CPV的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料的收集

采集2018—2019年安徽部分地區(qū)(合肥市區(qū)、長(zhǎng)豐縣、馬鞍山市)動(dòng)物醫(yī)院具有犬細(xì)小病毒感染癥狀的疑似病例糞便53份(合肥市區(qū)28份，命名為AHhf 1-28；長(zhǎng)豐縣7份，命名為AHcf 1-7；馬鞍山市18份，命名為AHmas 1-18)。

1.2 主要試劑

pMD TM 19-T載體、DL2000 DNA Marker、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、PrimeSTAR MAX聚合酶、EsTaq聚合酶、質(zhì)粒小提試劑盒、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中CPV-SH1516株(MG013488)基因序列，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)CPV鑒定引物(CPV-F/R)和3對(duì)特異性引物(C1-F/R-C3-F/R)用于擴(kuò)增中間片段；參照Han等[11]和Yu等[13]的方法設(shè)計(jì)特異性引物Y1、Y2，U1、U2分別用于擴(kuò)增CPV 3′端的Y型發(fā)夾結(jié)構(gòu)和5′端的U型發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成(表1)。

表1 鑒定與全基因組序列擴(kuò)增引物

1.4 CPV基因組DNA提取與鑒定

DNA提取試劑提取樣品DNA，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系：2×TaqPlus MasterMix(Dye)DNA聚合酶5 μL、CPV-F/R各0.5 μL、DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 CPV分型鑒定

為鑒定安徽地區(qū)31組陽(yáng)性病料感染CPV所屬亞型，PCR法擴(kuò)增CPV的VP2基因序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果鑒定合肥地區(qū)流行毒株的所屬亞型。

1.6 CPV全基因組擴(kuò)增與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，隨機(jī)選擇10株CPV陽(yáng)性樣品，采用表1引物分7段擴(kuò)增CPV全基因組。使用DNAStar軟件對(duì)擴(kuò)增的7段CPV基因片段進(jìn)行拼接，獲得完整的CPV序列，分析CPV的基因結(jié)構(gòu)。

1.7 CPV遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA 6.0軟件分析安徽10株CPV與NCBI中28株CPV參考株(表2)的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)序列特點(diǎn)分析NS1基因和VP2基因在遺傳進(jìn)化分支中是否同步，初步探究CPV在進(jìn)化的過(guò)程中是否涉及基因重組現(xiàn)象。

表2 CPV-2參考毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 CPV的PCR鑒定結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果顯示，53份待檢樣品中，有31份樣品擴(kuò)增出約1 031 bp大小的單一條帶(隨機(jī)選8株結(jié)果進(jìn)行展示，如圖1所示)，測(cè)序檢測(cè)確定為CPV陽(yáng)性樣品。

2.2 CPV分型鑒定

31份陽(yáng)性樣品CPV-VP2氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，4株VP2第297位氨基酸為Ala，且426位為Asn，屬于New CPV-2a，占總體12.90%；1株第297位氨基酸為Ala，且426位為Asp，屬于New CPV-2b，所占比例為3.23%；27株第297位氨基酸為Ala，且426位為Glu，屬于CPV-2c，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，比例為83.87%(表3)。綜上可見(jiàn)，安徽地區(qū)以CPV-2c為主要流行毒株。

表3 CPV安徽分離株關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)信息

2.3 CPV全基因組測(cè)序結(jié)果

以AHhf1擴(kuò)增結(jié)果為例，7對(duì)特異性引物均可擴(kuò)增出單一的核酸片段，且大小與預(yù)期一致(圖2)。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，7段擴(kuò)增產(chǎn)物均為CPV片段。

2.4 CPV基因組結(jié)構(gòu)分析

使用DNAStar軟件拼接10株CPV測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得10株完整的CPV序列。分析發(fā)現(xiàn)，安徽地區(qū)分離的10株CPV的基因組序列長(zhǎng)度在5 055～5 061 bp，長(zhǎng)度存在一定差異。ORF1和ORF2分別編碼主要的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2)，10株CPV的編碼區(qū)長(zhǎng)度相同；3′UTR長(zhǎng)度相同，均為269 bp，Y型回文結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度均為120 bp；5′UTR長(zhǎng)度為516～522 bp不等，U型回文結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度為193～199 bp(表4)，由此可見(jiàn)，10株CPV基因序列長(zhǎng)度差異主要是5′UTR核苷酸的突變、插入和缺失造成。

表4 10株CPV安徽株基因組結(jié)構(gòu)分析

2.5 遺傳進(jìn)化分析

基因組遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，38株CPV分為兩個(gè)進(jìn)化分支，其中，亞洲地區(qū)流行的24株(22株中國(guó)株、1株越南株和1株泰國(guó)株)形成一個(gè)單系群，而國(guó)外株(包括歐洲、美洲和大洋洲共14株)形成另一個(gè)單系群(圖3)。在中國(guó)株的單系群中，又可分為兩個(gè)進(jìn)化分支，安徽地區(qū)分離的10株CPV和其他14株CPV均起源于CPV-2aB004(EF011664)和CPV-LZ1(JQ268283)兩株，合肥地區(qū)流行的CPV主要以CPV-2c亞型為主，正在形成一個(gè)獨(dú)立的分支。NS1和VP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示，同一進(jìn)化分支中，NS1和VP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)之間不完全相同(圖4、圖5)。對(duì)于病毒而言，表面抗原(VP)和內(nèi)部抗原(NS)所經(jīng)歷的選擇壓力不同，為逃避宿主的免疫監(jiān)視，CPV的表面抗原突變的頻率會(huì)顯著高于內(nèi)部抗原[14]，因此VP2的變異比NS1發(fā)生得更快。同時(shí)，NS1和VP2基因在遺傳進(jìn)化分支中的不同步現(xiàn)象，也為CPV的重組提供了依據(jù)。

2.6 VP2抗原突變特征

氨基酸差異分析發(fā)現(xiàn)，安徽地區(qū)分離的6株CPV-2c毒株(AHhf1、AHcf4、AHhf1、ANhf7、AHhf27、AHhf28)的VP2蛋白與表2中CPV-2c參考毒株同源性高，沒(méi)有發(fā)生特異性的突變；安徽地區(qū)分離的3株NEW-CPV-2a(AHmas2、AHmas16、AHmas17)與表2中11株NEW-CPV-2a參考毒株相比，AHmas2的VP2蛋白存在4個(gè)新的氨基酸突變位點(diǎn)(第5位氨基酸由Asn突變?yōu)镚ly，第13位氨基酸由Pro突變?yōu)镾er，第370位氨基酸由Gln突變?yōu)锳rg，第426位氨基酸由Asn突變?yōu)镚lu)；安徽地區(qū)分離的1株NEW-CPV-2b與表2中4株NEW-CPV-2b參考毒株相比，存在部分氨基酸位點(diǎn)的突變，具體位點(diǎn)見(jiàn)表5。這種新的突變表示合肥毒株在形成地方特色的同時(shí)，也在不斷地進(jìn)化。但是這種突變是否引起VP2蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化，還需要進(jìn)一步研究。

3 討論

CPV 呈世界性分布，在中國(guó)和其他亞洲國(guó)家(包括韓國(guó)、泰國(guó)、日本、印度、蒙古[15]、越南[16]、老撾[17]等)以CPV-2a毒株為主要毒株，而許多歐洲、北美、拉丁美洲和非洲國(guó)家以CPV-2c毒株為主要流行毒株[18-20]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2009—2015年，在中國(guó)北京[21]、河南[22]、甘肅[11]、黑龍江[6]、四川[23]和南京[24]等省份流行的CPV毒株以New CPV-2a為主，且有少量New CPV-2b。2016年至今，我國(guó)以CPV-2c毒株感染發(fā)病的比例在逐漸增加，CPV-2c和New CPV-2a在中國(guó)部分區(qū)域成為優(yōu)勢(shì)毒株[25]。本研究對(duì)31株安徽地區(qū)分離的CPV分型發(fā)現(xiàn)，2018—2019年安徽地區(qū)流行的CPV主要以CPV-2c型(27/31株)為主。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，安徽地區(qū)分離的CPV正在形成了遠(yuǎn)離國(guó)外CPV-2分離株的單簇，這表明安徽地區(qū)流行的CPV主要毒株可能來(lái)源于原始CPV-2分離株，從而在中國(guó)地區(qū)進(jìn)一步適應(yīng)與進(jìn)化，而不是直接自國(guó)外引入。

VP2蛋白作為構(gòu)成CPV衣殼的主要成分，暴露于衣殼表面，決定病毒感染的宿主范圍、凝集血紅細(xì)胞等功能，是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[9]。CP的防控主要以荷蘭英特威(Intervet)、美國(guó)輝瑞(Pfizer)、法國(guó)梅里亞(Merial)和美國(guó)富道(Fort Dog)等公司生產(chǎn)的CPV弱毒疫苗為主。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，富道公司的CPV弱毒苗以CPV-2b毒株為疫苗株制備，其余公司的CPV弱毒苗都是以CPV-2為疫苗株制備。雖然有研究表明，疫苗株為CPV-2和CPV-2b的CPV疫苗對(duì)CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c突變體具有保護(hù)作用[26]，但是由于VP2抗原的高突變頻率，可能導(dǎo)致CPV毒株的中和抗原表位發(fā)生變化，導(dǎo)致已接種CPV疫苗株的犬群感染CPV[27]。分析安徽地區(qū)10株CPV的VP2氨基酸序列特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，表2中11株NEW-CPV-2a參考毒株相比，安徽地區(qū)分離的部分NEW-CPV-2a毒株存在4個(gè)新的氨基酸突變位點(diǎn)(第5位氨基酸由Asn突變?yōu)镚ly，第13位氨基酸由Pro突變?yōu)镾er，第370位氨基酸由Gln突變?yōu)锳rg，第426位氨基酸由Asn突變?yōu)镚lu)；安徽地區(qū)分離的1株NEW-CPV-2b與表2中4株NEW-CPV-2b參考毒株相比，存在部分氨基酸位點(diǎn)的突變(表5)。但是這種突變是否引起VP2蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化，還需要進(jìn)一步研究。

表5 VP2蛋白氨基酸突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

由于成年犬和已免疫犬發(fā)生犬細(xì)小病毒感染的數(shù)量日趨增加，因此，加強(qiáng)本地區(qū)CPV的流行病學(xué)研究和遺傳進(jìn)化分析具有重要意義。結(jié)合本研究和以往年份中國(guó)地區(qū)CPV亞型流行情況分析，CPV-2c已然成為安徽地區(qū)CPV-2的優(yōu)勢(shì)毒株，同時(shí)CPV-New2a與CPV-New2b共同參與循環(huán)。期望本研究可以為CPV的研究提供參考。