楊海健， 張?jiān)瀑F， 周心智， 洪 林， 楊 蕾， 彭芳芳， 王 武

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，重慶 401329)

血橙(CitrussinensisL. Osbeck)原產(chǎn)于地中海地區(qū)，四川和重慶是我國的主要栽培產(chǎn)區(qū)，品種以塔羅科血橙為主。血橙是典型的花色苷著色柑橘品種[1]，其紅色靚麗的外觀深受消費(fèi)者喜愛，紅艷的色澤可謂是血橙最重要的經(jīng)濟(jì)性狀[2]。引起血橙果皮著色的主要是花色苷和類胡蘿卜素，而花色苷起決定性作用[3]。花色苷是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，屬于黃酮類化合物[4]。研究認(rèn)為，花色苷有抵御紫外線損傷的作用[5]，同時(shí)還具有重要的營養(yǎng)和藥理作用，如抗氧化[6]、抗炎[7]、抗癌[8]、預(yù)防心血管疾病[9]等。血橙外觀品質(zhì)很大程度上代表著血橙的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，外觀一直是血橙產(chǎn)區(qū)關(guān)注的重點(diǎn)，而目前生產(chǎn)上存在不同程度的血橙果面著色淺的問題。血橙果面花色苷合成除遺傳因素外，外界環(huán)境對其合成積累也具有重要調(diào)節(jié)作用。作者前期已經(jīng)證實(shí)血橙果皮花色苷的合成受光照調(diào)控[3]，該研究在此基礎(chǔ)上，以塔羅科血橙新系為試驗(yàn)材料，進(jìn)一步研究了血橙轉(zhuǎn)色過程中(花后189～264 d血橙果皮由綠轉(zhuǎn)黃再轉(zhuǎn)紅)在不同PE材料遮光處理下的果皮花色苷動態(tài)含量、花色苷合成的主要基因的動態(tài)表達(dá)量，深入探索血橙果面花色苷積累受光調(diào)控的機(jī)理，以期為改善生產(chǎn)中血橙果面著色不良問題提供解決思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于重慶市萬州區(qū)武陵鎮(zhèn)塔羅科血橙園，該園為丘陵地果園，海拔256～300 m；土壤為紫色土，土壤pH 6.6～7.1，土層厚度40～55 cm，年平均氣溫17.7 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)1 484.4 h。于2019年10月選擇園內(nèi)受光條件較好的10株塔羅科血橙健康樹為試驗(yàn)樹。采用5種厚度(12絲)相同、顏色不同的PE透光袋作為遮光材料，顏色分別為透明、紅色、綠色、藍(lán)色、紫色。

1.2 試驗(yàn)處理

于2019年10月15日，對樹體外圍血橙果實(shí)進(jìn)行套袋遮光處理，袋子套好后剪掉袋子的4個(gè)角，利于透水透氣，以未套袋的外圍果實(shí)作為對照，由于紅色PE袋在日光下容易褪色，試驗(yàn)在血橙的整個(gè)轉(zhuǎn)色期需要對紅色PE袋進(jìn)行頻繁的換新。2019年4月25日為血橙謝花末期，采樣日期為2019年11月1日(花后189 d)至2020年1月15日(花后264 d)，每隔15 d采樣1次，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5個(gè)果實(shí)，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室立即削取果皮外皮層于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品測定

1.3.1 遮光袋透光率測定

采用紫外可見近紅外分光光度計(jì)(UV-7502C)分別測定各遮光袋在250～700 nm的透光率，每隔25 nm測定一次。

1.3.2 總花色苷含量測定

采用pH示差法[10-11]對不同采樣時(shí)期的各處理血橙果皮中總花色苷含量進(jìn)行測定。

1.3.3 果皮色澤測定

采用KONICA MINOLTA便攜式色差計(jì)對花后264 d各處理果實(shí)果面進(jìn)行色澤測定，每處理測定5個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)沿赤道均勻采集4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測定。

1.3.4 RNA提取、cDNA制備與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RNA提取與cDNA制備采用大量法并略作修改。液氮研磨0.5 g樣品成粉末，快速轉(zhuǎn)入已加入5 mL RNAiso Plus(TaKaRa)抽提液的15 mL離心管中，上下顛倒混勻后靜置15 min，加入1.5 mL氯仿，劇烈振蕩15～30 s后靜置10 min，在4 ℃下，10 000×g離心15 min，取上清至另一離心管中，再加入1.5 mL氯仿重復(fù)操作。上清液轉(zhuǎn)至新離心管后加入等體積異丙醇，室溫靜置2～3 min，4 ℃，10 000×g離心20 min，棄上清后加入1.5 mL預(yù)冷的75%乙醇，在-20 ℃冰箱中靜置30 min，再加入1.5 mL預(yù)冷的75%乙醇重復(fù)操作。10 000×g離心8 min，棄乙醇，按沉淀大小加DEPC水溶解。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分光光度計(jì)檢測，分裝。以提取的RNA為模板，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR。內(nèi)參基因選用EF-1α(登錄號XM_015533332)，內(nèi)參EF-1α、CHS、DFR、UFGT基因引物序列參考Crifò等[12]，Ruby、MYBF1、PAL、GST、ANS、CHI、C4H、4CL、F3H基因引物序列參考Carmona等[13]。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列

利用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，其中TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus) Ⅱ(2×)10 μL，PCR上下游引物10 μmol·L-1各0.4 μL，cDNA模板(<100 ng)8.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)模板做3次重復(fù)。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。反應(yīng)儀器為BIO-RAD CFX96TM Real-Time Systerm。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行整理分析與繪圖，利用SAS 8.0的SAS ANOVA多重分析比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同PE袋的透光率分析

采用分光光度計(jì)對5種顏色PE遮光袋進(jìn)行透光率測定(圖1)。結(jié)果顯示，無論是可見光還是紫外光部分，透明袋的透光率均為最高，且隨著波長變短，透明袋的透光率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在250～700 nm的整個(gè)光譜中，綠袋和紫袋表現(xiàn)出近似的透光曲線，透光率沿波長由長到短呈現(xiàn)緩波浪向下的趨勢。在300～700 nm的光譜中，紅袋與藍(lán)袋的透光率曲線趨勢相反，紅袋透光曲線的波峰和波谷正好與藍(lán)袋的波谷和波峰相遇，藍(lán)袋對紅光(620～700 nm)、黃光(580～620 nm)、UVA光(320～400 nm)的透過率明顯較其他PE袋差，而紅袋對綠光(490～580 nm)、藍(lán)光(450～490 nm)、紫光(400～450 nm)的透過率明顯較其他PE袋差，而在小于300 nm的光譜中紅、藍(lán)兩種PE袋表現(xiàn)相同的下降趨勢。在280～315 nm的(UVB、UVC)紫外光譜中，透明袋呈現(xiàn)最高的透光性(約為71.7%～63.6%)，綠袋和紫袋次之(約為55.2%～48.3%)，紅袋和藍(lán)袋的透光性則最差(約為48.4%～29.1%)。

2.2 不同PE袋遮光下血橙果皮總花色苷含量的變化

如圖2所示，在花后189 d血橙果皮正處在由綠轉(zhuǎn)黃時(shí)期；花后204 d對照血橙果皮完全轉(zhuǎn)黃；花后219 d對照血橙果皮開始出現(xiàn)肉眼可見的花色苷著色，透明袋中部分果實(shí)的果皮也開始顯現(xiàn)少量花色苷著色，其他PE袋處理著色不明顯；花后234 d，所有處理果皮均出現(xiàn)花色苷著色，只是紅袋和藍(lán)袋處理果皮花色苷著色較少；花后249～264 d，各處理果實(shí)果皮花色苷著色迅速增加，并根據(jù)果皮著色深淺可將其分為4組：對照血橙果實(shí)果皮著色最深，面積最大；透明袋處理次之；綠袋和紫袋處理再次之；紅袋和藍(lán)袋處理著色最淺。

如圖3所示，花后189～204 d各處理血橙果皮中均未檢測到花色苷含量。花后219 d，在除紅袋遮光以外的其余各處理血橙果皮中檢測出花色苷，其中，對照和透明袋處理果皮花色苷含量較高。之后，各處理果皮的花色苷含量增加，以對照果皮花色苷含量增加最快，透明袋處理次之，綠袋和紫袋處理再次之，紅袋和藍(lán)袋處理花色苷含量增加相對較慢。各處理果皮總花色苷測定結(jié)果與肉眼觀察的血橙著色基本一致。

色差計(jì)測定結(jié)果(表2)顯示，各處理間代表紅色的a值以對照最高，透明袋處理次之，紅袋處理最低，其中對照與綠袋、藍(lán)袋、紅袋處理的a值具有顯著性差異，而與透明袋和紫袋之間無顯著性差異，透明袋a值與紅袋、藍(lán)袋具有差異顯著性，a值由大到小分別為：對照>透明袋>紫袋>綠袋>藍(lán)袋>紅袋。而代表黃色的b值則呈相反趨勢：紅袋>藍(lán)袋>紫袋>透明袋>綠袋>對照。亮度值(L)表現(xiàn)為對照最低，套袋處理較高，且表現(xiàn)出PE袋的遮光率越高，遮光后果面越亮的趨勢。

表2 不同處理血橙果實(shí)表皮的色澤情況

2.3 不同PE袋遮光下血橙果皮花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)量的變化

血橙果肉中花色苷的代謝途徑研究得較為清晰。苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)、香豆酞 CoA連接酶(4CL)、在查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、類黃酮糖苷轉(zhuǎn)移酶(UFGT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) 等為血橙花色苷生物合成途徑中的主要結(jié)構(gòu)基因[13]。R2R3-MYB是花色苷生物合成的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)劑，而Ruby和MYBF1是R2R3MYB的轉(zhuǎn)錄因子[13-14]，二者對血橙花色苷的產(chǎn)生至關(guān)重要。

由圖4可知，遮光對血橙果皮花色苷合成相關(guān)基因的影響較大。8個(gè)結(jié)構(gòu)基因GST、ANS、CHS、DFR、F3H、UFGT、PAL、4CL和2個(gè)調(diào)節(jié)基因Ruby、MYBF1在遮光處理后的表達(dá)量明顯降低。其中基因GST、ANS、CHS、DFR、PAL、UFGT、Ruby在不同處理下的表達(dá)趨勢與對照一致，在果實(shí)逐漸成熟過程中均呈上升表達(dá)，只是表達(dá)量較自然光下有明顯降低。而基因F3H、MYBF1、4CL在遮光處理下的動態(tài)表達(dá)曲線與對照不同，遮光導(dǎo)致了這3個(gè)基因在果實(shí)轉(zhuǎn)色期間的表達(dá)增幅變小。自然條件下，這些基因在花后189～204 d維持在較低的表達(dá)水平，204～234 d表達(dá)量開始緩慢增長，234 d表達(dá)量進(jìn)入較快速增長，249 d表達(dá)量急速提升，迅速與遮光后的基因表達(dá)量拉開差距。而CHI、C4H兩個(gè)基因無論在自然光照下還是在遮光處理下，均未出現(xiàn)明顯上升表達(dá)。

遮光條件下，血橙果皮花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)與PE材料的透光性相關(guān)。結(jié)構(gòu)基因GST、ANS、CHS、DFR、F3H、UFGT、PAL、4CL和調(diào)節(jié)基因Ruby、MYBF1在果實(shí)成熟過程中的動態(tài)表達(dá)量可按遮光PE材料分為3組：透明袋表達(dá)量最高，紫袋、綠袋次之，紅袋、藍(lán)袋表達(dá)量最低，基本與各遮光PE材料對UVB、UVC的透過率相對應(yīng)，即透明袋透過率最高，其次為紫袋、綠袋，紅袋、藍(lán)袋透過率最低。

3 討論

血橙果實(shí)在成熟過程中的遮光處理，阻礙了果皮花色苷的合成，這種阻礙首先表現(xiàn)在時(shí)間上，遮光延遲了血橙果皮花色苷的合成時(shí)間，這點(diǎn)在所有不同顏色PE遮光袋上均有表現(xiàn)，其中以紅色袋表現(xiàn)最為明顯(圖3)。其次表現(xiàn)在面積上(圖2)，自然條件下，血橙果皮大部分面積裸露在光下，花色苷合成沿一個(gè)面或多個(gè)面同時(shí)合成，形成較大的花色苷著色面積，特別是在花后264 d，很多果實(shí)呈現(xiàn)整果面著色，而遮光處理的果面只是一部分或半邊著色，有些果面出現(xiàn)斑塊狀或斑點(diǎn)狀著色，著色不均。這可能與復(fù)雜的果面光際環(huán)境有關(guān)，因?yàn)镻E袋套果后袋子離果面的距離有遠(yuǎn)近差異，且袋子容易出現(xiàn)褶皺，光線在穿過PE袋時(shí)產(chǎn)生各種折射角度等都會引起果面受光的不同，在這些因素的附加作用下產(chǎn)生了復(fù)雜的果面光際環(huán)境。最后表現(xiàn)在著色深淺上，色差分析結(jié)果顯示了對照血橙的果皮紅色程度較遮光處理的深，這點(diǎn)肉眼即可辨別(表2)。遮光后血橙果面的亮度普遍較對照高，這與套袋在甜瓜[15]、芒果[16]、柑橘[17]、油梨[18]等水果上的表現(xiàn)一致。血橙果面亮度與PE袋的透光率成反比，透光率越低果面亮度越高，這可能與血橙果面花色苷著色相關(guān)，因?yàn)橛醒芯空J(rèn)為果實(shí)花色苷的含量與色差指標(biāo)中的亮度呈反比[19]。因此，血橙果面的受光環(huán)境也是影響果面亮度的重要因素。

不同PE材料對不同波長光的透過率存在差異。在560～700 nm的波段內(nèi)，按透光率可將PE袋分為3組：透明袋最高，紅袋、紫袋、綠袋中等，藍(lán)袋最低；400～550 nm的波段內(nèi)，也分為3組：透明袋最高，藍(lán)袋、紫袋、綠袋中等，紅袋最低；325～400 nm的UVA波段內(nèi)：透明袋最高，綠袋、紫袋、紅袋中等，藍(lán)袋最低；250～320 nm的UVB、UVC波段內(nèi)：透明袋最高，紫袋、綠袋中等，藍(lán)袋、紅袋最低。而在果實(shí)轉(zhuǎn)色期間，按血橙果皮總花色苷測定結(jié)果對PE袋進(jìn)行排序分組：透明袋最高，綠袋、紫袋中等，藍(lán)袋、紅袋最低，這與PE袋在UVB、UVC波段內(nèi)透光率一致。說明血橙果皮總花色苷合成與光射線中的UVB、UVC可能存在關(guān)系。

血橙轉(zhuǎn)色期間，觀察對照血橙的果皮花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)基因GST、ANS、CHS、DFR、F3H、UFGT、PAL、4CL和調(diào)節(jié)基因Ruby、MYBF1在轉(zhuǎn)色期間相對表達(dá)量呈現(xiàn)快速增加，因此，判斷這10個(gè)基因?qū)儆谘瘸墒爝^程中果皮花色苷合成關(guān)鍵調(diào)控基因，這與喻最新等[20]研究血橙果肉中花色苷合成關(guān)鍵基因結(jié)果類似，不同的是其未將PAL基因定為關(guān)鍵基因，而本研究結(jié)果顯示，在血橙果實(shí)轉(zhuǎn)色期間果皮PAL基因無論是在自然條件下還是在各遮光條件下均呈明顯上升表達(dá)。遮光造成了血橙果皮花色苷合成基因的相對表達(dá)量不及對照，尤其在花后249～264 d，顯得尤為明顯，差別幾倍至幾十倍。因此，判定這10個(gè)基因在血橙果皮花色苷合成過程中受到了光的調(diào)控。

值得注意的是，按遮光對血橙果皮花色苷合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響程度，對PE袋進(jìn)行排序分組，同樣將其分為3組：透明袋最高，綠袋、紫袋中等，藍(lán)袋、紅袋最低，又一次與PE袋在UVB、UVC波段內(nèi)透光率完美契合。再次印證了血橙果皮花色苷合成與光射線中的UVB、UVC關(guān)系密切。這點(diǎn)在其他植物果實(shí)上得到了驗(yàn)證，低劑量的UVB處理，能增加桃的花色苷含量[21]，UVC處理草莓能夠促進(jìn)總酚類和總花色苷的增加[22]。

血橙果皮花色苷合成關(guān)鍵基因均在花后234 d后開始大量表達(dá)，花后249 d后表達(dá)量驟升，因此，推測血橙果皮花色苷合成的關(guān)鍵時(shí)期在花后249 d以后，此時(shí)果皮花色苷開始大量合成，顏色快速增加。生產(chǎn)中部分果農(nóng)提早采收導(dǎo)致血橙果面著色淺、不均勻即為此原因，因此，血橙應(yīng)在花后249 d以后采摘較為適宜。由于透明袋的透光性較好，用透明PE材料遮光的血橙果皮總花色苷含量均高于其他幾個(gè)遮光處理。生產(chǎn)中重慶地區(qū)為預(yù)防血橙冬季落果，通常采用冬季樹體覆膜技術(shù)進(jìn)行保果，因此，在冬季血橙覆PE膜保果時(shí)為了降低對血橙果面正常著色的影響最好選用無顏色的透明膜。