向前勝，張 政，張登山*，王 寧，趙 越，孫 奎，鐵 軍，李積鑫，更桑才仁

1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.韶關(guān)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005 ；3.青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣自然資源局，青海 烏蘭 817100； 4.青海省海東市樂都區(qū)上北山林場，青海 海東 810699；5.青海省玉樹藏族自治州稱多縣自然資源局，青海 稱多 815000)

西北小檗(Berberisvernae)又名匙葉小檗，屬小檗科小檗屬植物，為落葉灌木。具有抗旱、耐寒、耐鹽堿、耐風(fēng)蝕等特性，具有很大的生態(tài)價(jià)值。其植物體內(nèi)含有豐富的次生代謝物小檗堿，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[1]，具有極高的藥用價(jià)值；最新研究表明,小檗堿可用作新型冠狀肺炎治療的潛在候選藥物[2]。除此之外，西北小檗植株具有較高的觀賞價(jià)值，常用作庭院綠化的觀賞樹種，果實(shí)可用作保健飲料開發(fā)和制作飼料的原料[3]。青海高原是西北小檗的重要分布區(qū)之一，主要分布在海拔2 300～4 000 m[4]。

前期關(guān)于青海高原西北小檗的研究主要集中在其體內(nèi)次生代謝物與海拔、緯度的關(guān)系等領(lǐng)域，并得出了藥用部位鹽酸小檗堿的含量隨海拔升高而增加的規(guī)律[5-8]。但是，對于不同海拔位置的西北小檗種源對環(huán)境的適用性研究及其對低溫條件的響應(yīng)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過收集玉樹藏族自治州玉樹市下拉秀鄉(xiāng)、西寧市大通縣新莊鎮(zhèn)、海東市樂都區(qū)上北山林場共3處種源西北小檗成熟種子進(jìn)行育苗，通過測定低溫處理下不同種源西北小檗枝條的相對電導(dǎo)率并擬合 Logistic 方程計(jì)算出不同種源的低溫半致死溫度，對其幼苗進(jìn)行低溫脅迫，測定葉片的生理指標(biāo)變化情況，比較不同種源的西北小檗幼苗對低溫脅迫的生理響應(yīng)規(guī)律，以期為西北小檗耐寒種質(zhì)的篩選、耐寒基因挖掘以及高海拔城鎮(zhèn)綠化樹種的種源地選擇及引種栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種源地概況

于2019年10月份分別從青海高原玉樹藏族自治州玉樹市下拉秀鄉(xiāng)、西寧市大通縣新莊鎮(zhèn)和海東市樂都區(qū)上北山林場的西北小檗自然分布群落收集成熟的種子。經(jīng)清洗、風(fēng)干、沙藏、殺菌等工序，于2020年4月播種在青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院溫室中，以沙粒土和黏土1∶2為基質(zhì)，繁育成苗。

表1 采種地概況信息表

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫半致死溫度試驗(yàn) 2020年9月份從育苗植株中選取粗度均勻150 d的新鮮枝條，每處種源15份，每份剪成10～15 cm長枝條，自來水沖洗干凈后，用去離子水沖洗3遍，紗布擦干，每處種源留下1份，其余塑封后放置于0 ℃低溫冰箱中備用。參照時(shí)朝等[9]的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置可調(diào)式低溫培養(yǎng)箱溫度梯度分別為-10 ℃、-20 ℃、-30 ℃、-40 ℃，冷凍處理以 5 ℃/h 的速度降溫，達(dá)到目標(biāo)水平后，維持12 h，然后室溫(16 ℃)解凍。對照處理 CK(16 ℃)為室溫。每處種源各個(gè)水平 3次重復(fù)。相對電導(dǎo)率采用DDSJ-308F電導(dǎo)儀 (上海雷磁) 進(jìn)行測定[10]，將相對電導(dǎo)率擬合成 Logistic 曲線方程測定半致死溫度[11-12]。

1.2.2 低溫脅迫試驗(yàn) 選取3處種源150 d生西北小檗幼苗為試驗(yàn)材料。由于玉樹藏族自治州的生長季4—9月份的月均氣溫為10.28 ℃，西寧市的生長季4—9月份的月均氣溫為13.3 ℃，海東市的生長季4—9月份的月均氣溫為12.28 ℃，故低溫培養(yǎng)箱低溫脅迫溫度分別設(shè)定為12 ℃、8 ℃、4 ℃和0 ℃，對照溫度條件為16 ℃，處理時(shí)間為48 h(光照黑暗處理各12 h，2次循環(huán))。經(jīng)低溫脅迫處理后，各處種源隨機(jī)挑選20棵苗，每株按從上至下的順序選取無病蟲害的第二對或第三對葉4～6片，采樣后迅速進(jìn)行試驗(yàn)。材料處理：將葉片表面灰塵擦去后用蒸餾水沖洗2～3遍，再用濾紙吸干表面蒸餾水，用剪刀除去葉脈，剩余部分剪碎備用。

1.2.3 生理指標(biāo)測定方法 可溶性糖含量采用蒽酮法[13]測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[14]測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[15]測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[16]測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法[17]測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[18]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2007進(jìn)行計(jì)算和作圖，用SPSS 22.0進(jìn)行 Logistic 方程擬合計(jì)算其低溫半致死溫度，同時(shí)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 3處種源西北小檗枝條低溫半致死溫度

將3處種源的西北小檗枝條在不同溫度處理下的相對電導(dǎo)率進(jìn)行Logistic方程擬合，得出各種源的低溫半致死溫度。研究結(jié)果表明：3處種源植物材料Logistic方程的擬合度R2值均高于0.950。玉樹市下拉秀鄉(xiāng)、西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)3處種源西北小檗枝條的半致死溫度分別為-21.55、-16.83、-15.78 ℃(表2)。從半致死溫度的結(jié)果來看，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的西北小檗抗寒性高于西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)種源。

表2 3處種源的西北小檗枝條相對電導(dǎo)率 Logistic 方程及半致死溫度

2.2 低溫脅迫后西北小檗葉片生理指標(biāo)的響應(yīng)

將低溫脅迫后的3處種源的西北小檗葉片生理指標(biāo)進(jìn)行多重比較。在整個(gè)低溫脅迫過程中，3處不同種源西北小檗幼苗的可溶性蛋白和可溶性糖含量多重比較見圖1。不同種源的西北小檗葉片可溶性蛋白和可溶性糖的含量對持續(xù)48 h的低溫脅迫條件的響應(yīng)不同。可溶性蛋白含量部分：在各低溫脅迫條件下，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的含量均高于西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)。隨著溫度降低，總體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在4 ℃條件下均達(dá)到最高值，含量分別為0.323 mg/g、0.317 mg/g和0.343 mg/g；0 ℃條件下相對于對照溫度均有增加，相互間差異不顯著。可溶性糖含量部分：3處種源可溶性糖含量隨溫度降低呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。在對照處理16 ℃條件下，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源可溶性糖含量低于西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)；隨著溫度降低，在12 ℃條件下玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源可溶性糖含量增大，均高于同溫度下的其他兩處種源，與海東市樂都區(qū)種源存在極顯著差異；在4 ℃條件下均達(dá)到最高值，分別為玉樹市下拉秀鄉(xiāng)41.10 mg/g、西寧市大通縣28.00 mg/g和海東市樂都區(qū)26.10 mg/g，且玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源與其他兩處種源間差異極顯著；隨著溫度降低，在0 ℃條件下，三者的可溶性糖含量均降低。

圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；下同。

在低溫脅迫條件下，3種不同種源西北小檗幼苗的MDA含量多重比較見圖2，由圖2可知，低溫脅迫對西北小檗葉片MDA的含量造成了不同程度的影響，且隨著溫度降低總體呈現(xiàn)升高趨勢。對照條件16 ℃溫度下，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的含量最高，為7.40 nmol/g，且與其他兩處種源存在顯著差異；隨著低溫脅迫的進(jìn)行，至0 ℃條件下，海東市樂都區(qū)種源MDA含量最高，為17.90 nmol/g，且與其他兩處種源間存在極顯著差異，西寧市大通縣種源含量最低，為13.50 nmol/g。通過與16 ℃條件對比，可以發(fā)現(xiàn)海東市樂都區(qū)種源的增加量最高，為14.70 nmol/g，且高于其他兩處種源；玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的增加量最低，為6.7 nmol/g，說明玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源對低溫的適應(yīng)性更強(qiáng)。

圖2 低溫脅迫后3處種源西北小檗葉片MDA含量

在低溫脅迫條件下，3處不同種源西北小檗幼苗的SOD、POD和CAT活性多重比較見圖3。由圖3可知，3處種源的西北小檗幼苗隨脅迫溫度的降低，其3種保護(hù)酶活性總體上呈現(xiàn)出先增加再降低的趨勢。在16 ℃條件下，海東市樂都區(qū)種源SOD活性低于玉樹市下拉秀鄉(xiāng)和西寧市大通縣；在12 ℃條件下，西寧市大通縣種源的SOD活性最高；在8 ℃、4 ℃及0 ℃條件下，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源SOD活性高于其他兩處種源；在4 ℃條件下，3處種源均達(dá)到最高值，其中玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源SOD活性最高，為2 258.60 U/g；與對照相比，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)、西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)的增加值分別為1 384.30、674.60、742.70 U/g。在16 ℃條件下，海東市樂都區(qū)種源POD和CAT活性高于其他兩處；在12 ℃條件下，西寧市大通縣種源的POD和CAT活性高于其他兩處；玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源在8 ℃時(shí)，POD和CAT活性均出現(xiàn)大幅上升，均高于其他兩處種源；在4 ℃的條件下，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的POD和CAT活性均較高，分別為132.60 U/g和142.20 U/g，與西寧市大通縣及海東市樂都區(qū)種源存在極顯著差異；在0 ℃條件下，3處種源的POD和CAT活性則降低。

圖3 低溫脅迫下3處不同種源西北小檗葉片3種保護(hù)酶活性圖

總之，在16 ℃和12 ℃時(shí)，玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的SOD、POD和CAT活性均低于西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)種源，當(dāng)溫度降低至8 ℃和4 ℃時(shí)，其3種保護(hù)酶活性的增加量均高于其他兩處種源，由此說明玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的保護(hù)酶系統(tǒng)在低溫條件下較其他兩處種源更敏感，能在低溫條件下迅速提高保護(hù)酶的活性，以減少體內(nèi)細(xì)胞遭受低溫帶來的損傷。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同種源的西北小檗低溫半致死溫度比較

不同種源的西北小檗均適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，高海拔地區(qū)的種源對低溫、強(qiáng)輻射和高溫差等極端的環(huán)境條件適應(yīng)性較強(qiáng)，低海拔地區(qū)的種源較能適應(yīng)溫和的生長條件。不同種源的西北小檗枝條在應(yīng)對初期低溫條件時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜還能通過主動運(yùn)輸進(jìn)行物質(zhì)交換，隨著低溫加劇，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重影響，質(zhì)膜被低溫破壞，主動運(yùn)輸功能完全喪失，同時(shí)，低溫造成離子活性下降，致使電導(dǎo)率值下降，隨著溫度降低，將使細(xì)胞遭受到不可逆的致死性傷害。在整個(gè)過程中，細(xì)胞逐漸經(jīng)歷的是一個(gè)從可逆到不可逆?zhèn)Φ陌l(fā)展過程。玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的西北小檗幼苗枝條的半致死溫度要低于西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)種源，說明玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的西北小檗對低溫的耐受性較強(qiáng)，在高海拔環(huán)境的生長進(jìn)化過程中已經(jīng)形成了一套能適應(yīng)較為惡劣的生態(tài)環(huán)境的生理體系。

3.2 低溫脅迫條件下，不同種源西北小檗可溶性糖和可溶性蛋白含量的比較

3處種源的西北小檗幼苗葉片的可溶性糖和可溶性蛋白含量在低溫脅迫過程中都呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢，并在4 ℃條件下均達(dá)到最大值，其中高海拔玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于其他兩處種源。在低溫條件下，可溶性糖含量的增加能提高細(xì)胞滲透濃度，以增加細(xì)胞的保水能力，降低其凝固點(diǎn)，從而提高植物抗寒性[19]；可溶性蛋白含量的增加，可能是通過提高質(zhì)膜中蛋白質(zhì)之間的親和力，以增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)在冰融過程中的穩(wěn)定性，從而提高其對低溫條件的適應(yīng)能力。在低溫脅迫初期，植物主要依賴細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量的增加，隨著脅迫程度加劇，則可能主要是依靠細(xì)胞內(nèi)蛋白含量的變化來提高其適應(yīng)性[20]。因此，高海拔種源的西北小檗葉片能通過增加體內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白的含量來適應(yīng)低溫條件，高海拔種源的西北小檗比低海拔種源更能適應(yīng)低溫環(huán)境。

3.3 低溫脅迫條件下，不同種源西北小檗的MDA含量比較

西北小檗在青海省的自然分布海拔為2 300～4 000 m[4]，高海拔地區(qū)的種源較能適應(yīng)強(qiáng)輻射、低溫的惡劣環(huán)境；低海拔種源的植物在進(jìn)化過程中對惡劣環(huán)境的敏感度較高，但適應(yīng)能力較差。玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的西北小檗由于分布海拔較高，生長期的月均氣溫較其他兩處種源低，在長期的自然選擇下，其可能已形成了對極端環(huán)境條件的結(jié)構(gòu)型性狀和功能型性狀的適應(yīng)性，在低溫、強(qiáng)輻射和高溫差的條件下，細(xì)胞膜系統(tǒng)的敏感性及穩(wěn)定性較強(qiáng)，因此，該處種源的幼苗葉片在16 ℃條件下的MDA含量較其他種源高。中、低海拔兩處種源所處的環(huán)境條件較好，生長期的月均氣溫較高，在生長過程中遇到極端條件的頻率較少，細(xì)胞膜系統(tǒng)對低溫條件的反應(yīng)較劇烈，且穩(wěn)定性較差，在低溫脅迫加劇的過程中，西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)種源的幼苗葉片較易受到低溫的傷害，因此，MDA的增加量顯著高于玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源，且低海拔的海東市樂都區(qū)種源的增加量要高于中海拔的西寧市大通縣種源。同時(shí)也說明，高海拔處的玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)對低溫條件的抵御能力要強(qiáng)于低海拔種源，其葉片膜質(zhì)過氧化作用強(qiáng)度及質(zhì)膜受損傷程度要低于低海拔種源，對低溫的適應(yīng)能力則表現(xiàn)出高海拔種源強(qiáng)于低海拔種源。

3.4 低溫脅迫條件下，不同種源西北小檗保護(hù)酶活性的比較

在一定的低溫范圍內(nèi)，保護(hù)酶活性的增加能有利于植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡，來減輕膜質(zhì)過氧化對細(xì)胞造成的傷害。SOD作為保護(hù)酶系統(tǒng)的第一道防線，能將毒性較強(qiáng)的O2-歧化為毒性較弱的H2O2，而CAT與POD協(xié)同作用，則將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，徹底清除活性氧對植物細(xì)胞的損害[21-22]。3處種源的西北小檗幼苗在低溫脅迫過程中，隨著溫度的降低，其各類保護(hù)酶活性總體上呈現(xiàn)出增加的趨勢，以提高組織的抗寒性，降溫至一定范圍時(shí)，細(xì)胞膜受到嚴(yán)重傷害，酶的活性開始下降[23]。其中高海拔玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源3種保護(hù)酶活性的變化趨勢與西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)存在較大不同，在16 ℃和12 ℃低于低海拔的兩處種源，隨著溫度降低，在12～4 ℃，增加量遠(yuǎn)高于其他兩處種源，在0 ℃達(dá)到最高值，且均高于其他兩處種源。說明玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的西北小檗由于長期生長在高海拔地區(qū)，其植物體細(xì)胞內(nèi)對由于逆境產(chǎn)生的活性氧傷害的反應(yīng)較低海拔種源更為敏感，能在一定溫度范圍內(nèi)迅速提高體內(nèi)保護(hù)酶的活性，以應(yīng)對逆境對細(xì)胞的傷害，來維持細(xì)胞體內(nèi)活性氧代謝的平衡狀態(tài)。植物在應(yīng)對外界逆境條件時(shí)，葉片是最能反應(yīng)植物與環(huán)境的適應(yīng)關(guān)系的部位，其中細(xì)胞膜系統(tǒng)是感受低溫脅迫最敏感的部位，也是植物受低溫傷害和抵抗低溫傷害的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[24]。在低溫脅迫初期，細(xì)胞膜首先感受到低溫條件，隨著低溫的加劇，質(zhì)膜受損傷的程度也逐漸加劇，MDA的含量增加，高海拔玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的增加量最少，低海拔海東市樂都區(qū)種源的增加量最多。同時(shí)，葉肉細(xì)胞通過調(diào)整體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和保護(hù)酶活性的變化以抵御低溫脅迫的傷害，由于不同種源的植物對逆境生理的反應(yīng)能力不同，高海拔種源的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量及保護(hù)酶活性的增加量要高于低海拔種源，表現(xiàn)出高海拔種源西北小檗具有較強(qiáng)的低溫耐受能力。

通過對玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源、西寧市大通縣種源和海東市樂都區(qū)種源150 d生長期的西北小檗枝條和葉片分別進(jìn)行低溫半致死試驗(yàn)和低溫脅迫試驗(yàn)，分別得到3處種源的枝條半致死溫度，由低到高分別為玉樹市下拉秀鄉(xiāng)-21.55 ℃、西寧市大通縣-16.83 ℃、海東市樂都區(qū)-15.78 ℃。同時(shí)，也得到了高海拔玉樹市下拉秀鄉(xiāng)種源的低溫脅迫生理指標(biāo)要優(yōu)于低海拔的海東市樂都區(qū)和西寧市大通縣種源的結(jié)論，其主要原因可能是高海拔種源在長期生長進(jìn)化過程中已經(jīng)形成了應(yīng)對低溫逆境的適應(yīng)體系。本研究能夠從一定層面反映出玉樹市下拉秀鄉(xiāng)、西寧市大通縣和海東市樂都區(qū)三處西北小檗種源的抗寒性強(qiáng)弱，可為西北小檗耐寒種質(zhì)資源的篩選、耐寒基因的挖掘以及青海高原三江源地區(qū)高海拔城鎮(zhèn)綠化樹種種源地的選擇和植物資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。