魏 歆，林芳明，雷生妍，張紅見，賈彩惠，葛麗萍，趙 靜*

(1.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016；2.青海省食品檢驗檢測院，青海 西寧 810008；3.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西 西安 710016)

多殺性巴氏桿菌可引起牦牛出血性敗血癥，它是一種急性呼吸系統(tǒng)傳染病，簡稱為牛出敗，俗稱“嗓喉”。該病通常由致病菌內(nèi)源感染引起發(fā)病，健康牦牛通過直接接觸而感染，雖大多數(shù)牦牛接種了牛出敗疫苗，但是該病在牦牛養(yǎng)殖區(qū)仍然頻發(fā)，藥物治療也僅對早期發(fā)病的牦牛有效。青海省是我國主要的牦牛養(yǎng)殖地，牛出敗對青海省牦牛的健康養(yǎng)殖造成了極大的危害和巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。目前防治牦牛出血性敗血癥最有效的方法便是抗生素治療和接種疫苗兩種，但隨著抗生素濫用導致多殺性巴氏桿菌耐藥問題愈漸嚴重[3]，使用抗生素臨床治療牦牛牛出敗效果不容樂觀，所以疫苗成了防治該病最好的手段?，F(xiàn)有的牛出敗疫苗有滅活疫苗[4]、弱毒疫苗[5]、亞單位疫苗[6]、重組疫苗[7]以及DNA疫苗[8]，后三種疫苗雖免疫效果良好，但因為操作復雜、技術(shù)還不太成熟等多方面原因，沒有被廣泛應用?，F(xiàn)目前應用最廣泛的是滅活疫苗和弱毒疫苗兩種。弱毒疫苗相較于滅活疫苗，能誘導血清型間交叉保護且細胞免疫應答效果優(yōu)于滅活疫苗，但缺點是安全性不如滅活疫苗，它會引起牦牛全身性感染和疫病爆發(fā)的危險[9]，且極不便于運輸[10]，所以本次試驗選用了滅活疫苗。滅活疫苗的優(yōu)點在于安全性好，制品穩(wěn)定，且方便運輸。目前國內(nèi)上市的牦牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗有B群C45-2、C46-2以及C47-2三種疫苗株，青海省常用的為C45-2疫苗株。

本研究制備了地方血清型野生株P(guān)0910和臨床常用的商品疫苗株C45-2滅活疫苗，分別免疫20頭牦牛后通過高效、快速的間接ELISA試劑盒檢測牦牛血清抗體水平，評價兩種疫苗的免疫效果，以期為青海省牦牛出血性敗血癥的防控提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：多殺性巴氏桿菌疫苗株C45-2(青海省生物藥品制品廠)、地方血清型野生株P(guān)0910(青海大學農(nóng)牧學院傳染病實驗室分離)。

試驗動物：6周齡昆明系小白鼠(18～22 g，雌雄各半)，購自青海省地方病研究所；健康家兔(1.5～2 kg)，購自青海大學農(nóng)牧學院實習牧場；牦牛，青海省黃南藏族自治州尖扎縣牦牛養(yǎng)殖場。

血清：試驗血清采自用多殺性巴氏桿菌疫苗株C45-2、地方血清型野生株P(guān)0910制成的疫苗免疫健康牦牛；陰性血清是健康牦牛血清；陽性血清是試劑盒自帶，ELISA試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 C45-2和P0910菌株的活化培養(yǎng) 將保存的疫苗株C45-2和野生株P(guān)0910兩種菌株分別用血清平板復蘇，然后分別挑取單個菌落依次各接種于2個5mL TSB肉湯中，37 ℃，180 r/min，搖床震蕩培養(yǎng)20 h后，再分別將其全部接種于500 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱培養(yǎng)46 h。

1.2.2 C45-2和P0910的菌落計數(shù) 將已培養(yǎng)好的菌液進行稀釋，并接種于TSA培養(yǎng)基平板上，37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，所得C45-2和P0910菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，則為該菌的總活菌數(shù)。參照張紅見等[11]的測定方法用生理鹽水將培養(yǎng)的菌液做10倍系列的梯度稀釋度10-6～10-10，做成5組等級梯度劑量。用麥氏比濁管來判定這兩株菌液的菌數(shù)是否達到30億/mL。分別將2株菌的這五個稀釋度的稀釋菌液每個TSA板上滴加 0.1 mL進行涂布，每組3個重復，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)30 min后，倒置培養(yǎng)24 h，備用。數(shù)出每個平板的總菌落數(shù)，計算出每3個平板上的平均菌落數(shù)，然后乘以稀釋倍數(shù)，再乘以10，即為1 mL原菌液中所含的總菌數(shù)。

1.2.3 疫苗的制備 在純度經(jīng)過檢驗的菌液中無菌加入菌液總量的0.5%的甲醛溶液，放入搖床，37 ℃，200 rpm，震蕩培養(yǎng)12 h。將用甲醛滅活后的C45-2和P0910菌液用接種環(huán)依次各劃線接種于3個TSA培養(yǎng)基平板中，37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h以上。觀察有無細菌生長，驗證菌液是否完全滅活。然后將已用甲醛滅活后的C45-2和P0910菌液分別按5∶1的比例加入滅菌的Al(OH)3膠(因為鋁膠佐劑本身會在注射部位產(chǎn)生肉芽腫，還容易引發(fā)變態(tài)反應等一系列不良反應[12]，所以添加鋁膠佐劑必須得嚴格按照《獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定的比例添加鋁膠佐劑)進行配苗，同時按疫苗總量的0.005%加入0.2%苯酚，充分震蕩搖勻，放置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 疫苗安全性檢驗 小白鼠安全性檢驗：分別將制備好的C45-2、P0910疫苗各皮下注射4只小白鼠(雌雄各半)，每只注射0.3 mL，設立試驗對照組，連續(xù)觀察14 d。

家兔安全性檢驗：分別將制備好的C45-2、P0910疫苗各皮下注射4只家兔，每只注射5 mL，并設立試驗對照組，連續(xù)觀察14～21 d。

1.2.5 毒力試驗 最小致死量的測定是將6只體重為1.5～2 kg的兔子(雌雄各半)隨機分成 2組，每組3只，每只兔子皮下注射不同的活菌數(shù)，觀察3 d，測定最小致死量。其方法：分別將C45-2、P0910接種于TSB培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水將菌液分別做10倍系列稀釋，每個稀釋度需更換一個槍頭，稀釋至 1×10-11，選擇10-7～10-9三個稀釋度，分別將2株菌的三個稀釋度的稀釋菌液用200μL的移液槍各接種于3個TSA平板上，每個平板滴加0.1 mL，輕輕晃動平板，并用滅菌的涂布棒使菌液均勻散開，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)30 min后，倒置培養(yǎng)24 h，計算出1～5個活菌數(shù)的菌液量，按前面分好的組，分別注射到相對應的兔子體內(nèi)，對照組兔子則注射PBS。

1.2.6 效力檢驗 疫苗免疫：用體重1.5～2 kg的12只兔子(雌雄各半)隨機分成3組，1、2組兔子分別皮下注射1 mL 已制備好的C45-2、P0910疫苗，第3組兔子注射1 mL PBS作對照。連續(xù)觀察14～21 d。

攻毒保護試驗：連續(xù)觀察14 d后，將上述已免疫的3組兔子，分別用相對應的強毒株菌液1 mL攻毒(注射方式同上)，連續(xù)觀察14 d，統(tǒng)計各組兔子死亡數(shù)，計算各免疫組的保護率。通過該試驗便可知道自制的疫苗的免疫效果如何。

1.2.7 應用商品化ELISA試劑盒檢測C45-2、P0910疫苗的免疫效果 試驗血清的制備,取4、5 mL的疫苗株C45-2滅活疫苗分別免疫10頭牦牛；取4、5 mL的地方血清型野生株P(guān)0910滅活疫苗同樣分別免疫10頭牦牛，共計免疫40頭牦牛。分別在30、90、180 d采取免疫后牦牛血液，無菌分離血清，并分裝滅菌EP管，-20 ℃冰箱保存。

用商品化的ELISA試劑盒按操作說明檢測上述所制備好的血清臨床樣品，共計120份。將試劑盒中自帶的標準品用稀釋液稀釋五個梯度，以五個標準品的稀釋梯度濃度為縱坐標，OD450值為橫坐標繪制出標準曲線，再根據(jù)標準曲線得到其直線回歸方程式，將樣品的 OD450值代入方程式，便可計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。且以標準品的最大稀釋倍數(shù)即最小濃度為判定樣品陰陽性的臨界值。

2 結(jié)果與分析

2.1 C45-2和P0910的活菌計數(shù)

由表1、表2可知，C45-2的稀釋度為10-6、10-7、10-8時的菌液濃度分別為5.35×109、1.78×1010、5.30×1010CFU/mL，C45-2的菌液濃度取這三個濃度的平均值，即2.54×1010CFU/mL；P0910的稀釋度為10-7、10-8、10-9的菌液濃度則為3.10×1010、4.23×1010、4.43×1010CFU/mL，所以P0910的菌液濃度為3.93×1010CFU/mL。由此可看出兩株菌都在很短的時間內(nèi)到達了3×109CFU/mL，達到了制備疫苗的標準[13]。

表1 C45-2活菌計數(shù)

表2 P0910活菌計數(shù)

2.2 疫苗的無菌檢驗

將接種菌苗的TSA置于37 ℃溫箱，連續(xù)培養(yǎng)7 d后未見到任何菌落形成，則說明所制備疫苗無菌檢驗合格。

2.3 疫苗的安全性檢驗

2.3.1 小白鼠安全性檢驗 接種疫苗株C45-2、野生株P(guān)0910滅活疫苗后個別小白鼠在最初的5～7 h內(nèi)表現(xiàn)為輕度精神沉郁，之后很快恢復正常。所有小白鼠在約14 d的觀察期內(nèi)未見任何異常表現(xiàn)，注射部位無硬塊和潰爛，這說明疫苗的安全性符合標準要求。

2.3.2 家兔安全性檢驗 接種疫苗株C45-2、野生株P(guān)0910滅活疫苗后個別家兔在最初的 1～2 d 內(nèi)有輕度精神沉郁，攝食量減少等表現(xiàn)，之后很快恢復正常。但是在接種疫苗株C45-2滅活疫苗的第4天有一只家兔死亡，經(jīng)剖檢觀察，各臟器均無明顯的異常變化，觸片鏡檢也并未發(fā)現(xiàn)菌體存在。

2.4 毒力試驗

2.4.1 C45-2和P0910的最小致死量(MLD)測定 每只兔子皮下注射不同的活菌數(shù)，兩組兔子的死亡情況見表3、表4。由表3可知，接種疫苗株C45-2疫苗的這組小鼠，注射2個活菌數(shù)就已經(jīng)死亡；從表4可知，接種野生株P(guān)0910疫苗，注射2個活菌數(shù)小鼠存活，而注射了3個活菌數(shù)時小鼠死亡，說明野生株P(guān)0910的最小致死量為3個活菌數(shù)。

表3 接種C45-2的活菌計數(shù)

表4 接種P0910的活菌計數(shù)

2.5 攻毒保護試驗

由表5可知，經(jīng)C45-2、P0910全菌滅活疫苗免疫后的兔子均可在一定程度上抵抗強毒株的攻擊，其中P0910滅活苗保護效果較好，保護率為100%，高于C45-2滅活疫苗(保護率為90%)。

表5 攻毒試驗結(jié)果

2.6 間接ELISA方法檢測C45-2和P0910疫苗的免疫效果

2.6.1 樣品濃度的計算 測量3次采樣樣品的標準曲線如圖1所示。

直線回歸方程為y30 d=11.476x2+62.502x-1.281 2(R2=0.998 4)、y90 d=2.534 9x2+72.854x-8.214 1(R2=0.996 3)、y180 d=29.239x2-13.237x+11.301(R2=0.993 8)。從直線回歸方程的R2系數(shù)可看出該曲線的擬合程度比較高，可以用此來計算樣品的濃度。

2.6.2 臨床樣品檢測

將 120份臨床血清樣品用 ELISA 試劑盒進行檢測，檢測抗體消長規(guī)律，結(jié)果見表6和圖2。

表6 待測血清濃度平均值

圖2 四組疫苗免疫牦牛后抗體消長的曲線

由表6、圖2可知，免疫牦牛血清抗體水平在接種后一個月達到高峰，隨后逐漸下降。相同免疫劑量時地方血清型野生株P(guān)0910抗體水平高于疫苗株C45-2；不同免疫劑量，接種5 mL滅活疫苗的抗體水平要高于4 mL滅活疫苗的抗體水平。

3 討論與結(jié)論

牦牛養(yǎng)殖業(yè)作為高原地區(qū)的重要經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)之一，對促進牧民增收、牧業(yè)增效具有重要的推動作用，但牦牛出血性敗血癥作為危害牦牛的常發(fā)和多發(fā)病，給青海省牦牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。從安全性和經(jīng)濟適用性方面來看，制備高效特異的地方血清型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗是作為防控青海省牦牛出血性敗血癥最有效的途徑之一。

本研究中用于制備免疫疫苗的菌株P(guān)0910為課題組分離的地方血清型野生菌株，而作為對照的C45-2為生產(chǎn)中使用的疫苗株。從活菌計數(shù)的試驗結(jié)果可以看出P0910和C45-2兩株菌都可以在短時間內(nèi)達到制備標準疫苗的濃度，即3.93×1010CFU/mL和2.54×1010CFU/mL，并由此可知地方血清型野生株P(guān)0910的生長繁殖速度要略快于疫苗株C45-2，這可能是由于C45-2長期作為疫苗菌株，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，病原菌失去莢膜，導致其活力逐漸下降的緣故[14]，而新分離到的野生株P(guān)0910活力強，做成疫苗的效果也會高于疫苗株C45-2。從毒力試驗結(jié)果來看，C45-2注射2個活菌數(shù)試驗兔便死亡，而P0910的最小致死量則為3個活菌數(shù)，說明C45-2的毒力要高于野生株P(guān)0910，毒力差異之間的分子機制還需進一步研究。疫苗的安全性對于制備疫苗來說是十分重要的，它主要表現(xiàn)為注射疫苗后動物機體產(chǎn)生的不適反應。從安全性試驗結(jié)果可以看出疫苗株C45-2和地方血清株P(guān)0910疫苗免疫小鼠和家兔后都無嚴重的不良反應，只在注射初期表現(xiàn)出輕度精神沉郁、攝食量減少等表現(xiàn)，后期恢復正常。其中有一只家兔注射了C45-2疫苗4 d后死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)兔子臟器無任何明顯的病變，觸片鏡檢后也未發(fā)現(xiàn)有菌體存在，這證明了該兔子的死亡與注射疫苗無直接的關(guān)系，這可能和兔子的個體差異有關(guān)。從攻毒保護試驗的結(jié)果可以看出P0910的保護率(100%)要優(yōu)于C45-2(90%)，說明野生株P(guān)0910疫苗的效力高于疫苗株C45-2。由此可知無論是基于疫苗的安全性考慮還是從疫苗保護效率來看，P0910制備的滅活疫苗都能夠為牦牛提供良好的保護，所以將P0910 滅活疫苗作為新型的青海省當?shù)仃笈Ｃ庖吆蜻x疫苗型是可行的。

本試驗應用間接ELISA方法對用疫苗株C45-2和野生株P(guān)0910滅活疫苗免疫的牦牛血清進行檢測，從試驗結(jié)果可以看出P0910疫苗的免疫效果優(yōu)于C45-2，接種疫苗一個月后抗體水平達到最高，然后逐漸下降，直至6個月后抗體水平達到最低。黃忠等[15]用巴氏桿菌株C48-1制作的禽霍亂疫苗免疫櫻桃谷鴨，利用間接ELISA方法檢測試驗鴨的抗體滴度，結(jié)果顯示在免疫禽霍亂疫苗4周后抗體滴度達到最高值，之后抗體水平逐漸下降，這與本研究試驗結(jié)果類似。同時接種5mL疫苗的牦牛體內(nèi)抗體達到了較高的水平，說明疫苗的免疫效果與其劑量是呈正相關(guān)的。據(jù)此可制定再次接種疫苗的時間，為科學制定牦牛出血性敗血癥免疫程序提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

綜上所述，本試驗室自制的地方血清型野生株P(guān)0910滅活疫苗具有較高的安全性，且通過疫苗保護性試驗以及抗體檢測結(jié)果可以看出，地方型血清株P(guān)0910的免疫效果較疫苗株C45-2要高，具備作為防控青海省牦牛出血性敗血癥滅活疫苗候選株的良好潛質(zhì)。