朱 杰，楊 瑩，程 亮，朱海霞，張 綱，趙 云，郭青云*

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016； 2.海東市樂都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，青海 海東 810700； 3.西寧市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，青海 西寧 810016)

藜(Chenopodiumalbum)是一種耐鹽的藜科藜屬植物[1]，適應(yīng)性強(qiáng)，在干旱環(huán)境條件下生長(zhǎng)旺盛[2]。目前防除雜草藜主要利用人工機(jī)械除草和化學(xué)藥劑，由于化學(xué)防治存在殘留、抗性等缺點(diǎn)[3-5]，生物防治可以作為一種補(bǔ)充傳統(tǒng)防治的潛在選擇[6]。具有除草活性的微生物資源成為研究微生物源除草劑的熱點(diǎn)[7]。生物除草劑不僅對(duì)雜草具有較好的防效[8-10]，還可以增加作物產(chǎn)量[11]，不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生危害。朱海霞等[12]研究得出多孢木霉對(duì)密花香薷和野燕麥等具有良好的除草效果，并且對(duì)豌豆和蠶豆無毒害作用；另外，使用微生物源除草劑可以改善物種群落結(jié)構(gòu)，Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)生防菌(Sclerotiumrolfsii)與化學(xué)除草劑相比，生防菌顯著改善了加拿大一枝黃花入侵生境的雜草群落結(jié)構(gòu)。由此可知，利用生防菌防治雜草具有生態(tài)和經(jīng)濟(jì)的雙重效益。

青藏高原具備獨(dú)特的氣候環(huán)境，擁有豐富的極境微生物種群，為開發(fā)利用微生物資源提供有利條件[14]。本課題組從青海省平安縣發(fā)病楊樹葉片上分離得到出芽短梗霉菌株P(guān)A-2，前期對(duì)菌株P(guān)A-2進(jìn)行除草活性測(cè)定，研究表明該菌株對(duì)藜的鮮重防效達(dá)78.46%[22]，其可濕性粉劑對(duì)藜的鮮重防效最高可達(dá)75.0%[23]，但前期研究缺少藜保護(hù)酶和超微結(jié)構(gòu)的研究。有研究表明，植株受到病原菌侵染后，寄主細(xì)胞和組織將發(fā)生一系列與致病性相關(guān)的生理生化反應(yīng)，這些反應(yīng)常常涉及到植株水分和養(yǎng)分運(yùn)輸[15]、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[16]、病害產(chǎn)生[17]以及光合作用和其他代謝過程[18-21]。鑒于此，本研究通過對(duì)出芽短梗霉菌PA-2粗提物脅迫前后的藜植物體內(nèi)保護(hù)酶活性、滲透性物質(zhì)、光合色素、丙二醛、可溶性蛋白和可溶性糖以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析，為解析出芽短梗霉菌PA-2對(duì)藜侵染的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)PA-2:青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從自然感病楊樹葉上分離獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)在青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。參考本課題組先前優(yōu)化的培養(yǎng)基，制備出芽短梗霉菌PA-2的發(fā)酵液，備用。

在植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)放置10個(gè)花盆，在田間劃5個(gè)小區(qū)，在每個(gè)花盆及小區(qū)里移栽5株3～4葉期的藜幼苗，使幼苗生長(zhǎng)到8葉期時(shí)，將上述PA-2發(fā)酵液用無菌水稀釋到106～108CFU/mL的濃度，然后分別接種20 mL至5盆(區(qū))藜上，另外5盆接種無菌水作為對(duì)照。在相對(duì)濕度約為60%，溫度為20 ℃，分別在噴施第1天～第7天后采集處理組、田間組和對(duì)照組藜葉片。在每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)，采集5株長(zhǎng)勢(shì)一致植株所有中間葉片，設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

葉綠素含量[24]的測(cè)定：稱取不同處理的0.1 g藜葉片，放入研缽中，在95%乙醇條件下浸泡 24 h。以95%乙醇作為空白對(duì)照，分別在波長(zhǎng)665、649、470 nm下測(cè)定其對(duì)應(yīng)吸光度(OD)。665 nm和649 nm分別是葉綠素a和葉綠素b最大吸收波長(zhǎng)。利用下述公式分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度(mg/mL)，然后計(jì)算葉綠素的總濃度(mg/mL)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

葉綠素a=13.95A665-6.88A649

葉綠素b=24.96A649-7.32A665

類胡蘿卜素=(1 000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

葉綠素含量=(葉綠素總濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重

丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用TBA法[24]；過氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨法[25]；過氧化物酶(POD)活性采用俞創(chuàng)木酚法[26]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用羥胺法[26]；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性采用苯丙氨酸比色法[27]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法[27]；可溶性糖采用蒽酮比色法[27]。

1.4 藜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

分別在噴施PA-2發(fā)酵液1、2、3 d選取5片新鮮藜葉，輕輕擦凈組織表面污物，將葉片切成0.5 mm×0.5 mm的小方塊，每個(gè)處理制作15個(gè)切塊，投入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定液中，真空抽氣至葉片完全浸入固定液中，4 ℃放置過夜，將初固定的樣品取出，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)漂洗3次(每次15 min)，再用1%的鋨酸溶液固定3 h，經(jīng)蒸餾水漂洗后，用70%、80%、90%、95%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度進(jìn)行15 min，中間用丙酮過渡，最后使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行滲透并包埋[28]。KLB5型切片機(jī)切成片后，使用醋酸鈾加檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，在透射電鏡(Japan，HITACHI-7650)下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Excel 2005和SPSS 14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 出芽短梗霉菌PA-2粗提物對(duì)藜葉片生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1 對(duì)藜葉片丙二醛(MDA)含量的影響

由圖1a可以看出，在田間試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中藜葉片MDA含量均高于對(duì)照，在第2天和第4天時(shí)，盆栽處理與田間處理分別出現(xiàn)峰值。第2天，盆栽試驗(yàn)中，藜葉片內(nèi)的MDA含量上升至最大值，整體含量變化趨勢(shì)是先上調(diào)后平緩下調(diào)；田間試驗(yàn)中MDA含量在第4天達(dá)到最大值，第6天接近對(duì)照。噴霧第2天時(shí)，MDA含量差異較大，盆栽處理比空白對(duì)照處理的MDA含量增加了580.0%，盆栽處理比田間處理的MDA含量增加了161.5%。

2.1.2 對(duì)藜葉片過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖1b可以看出，在田間試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中藜葉片CAT酶活性均高于對(duì)照，盆栽處理在第2天達(dá)到最高值，后總體水平呈下降趨勢(shì)；田間處理中CAT酶活性在第4天時(shí)達(dá)最大值，總體含量低于盆栽處理。經(jīng)噴霧第2天時(shí)，不同處理CAT酶活性差異較大，盆栽處理比空白對(duì)照處理的CAT酶活性增加了367.2%。經(jīng)噴霧4 d時(shí)，田間處理比空白對(duì)照處理的CAT酶活性增加了143.5%。

2.1.3 對(duì)藜葉片過氧化物酶(POD)活性的影響

由圖1c可以看出，在田間試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中藜葉片POD酶活均高于對(duì)照。盆栽處理在第2天達(dá)到最高值；田間處理中POD含量在第3天達(dá)最大值，第6天接近對(duì)照。盆栽試驗(yàn)中POD酶活性高于田間試驗(yàn)和對(duì)照。第2天時(shí)POD酶活性差異較大，盆栽處理比空白對(duì)照處理的POD酶活性增加了72.5%。盆栽處理比田間處理的POD酶活性增加了32.1%。

2.1.4 對(duì)藜葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由圖1d可以看出，在田間試驗(yàn)中藜葉片SOD酶含量低于對(duì)照，第2天和第4天出現(xiàn)峰值，第2天達(dá)最大值；盆栽試驗(yàn)在第1天～第2天、第4天～第7天低于對(duì)照，在第3天～第4天高于對(duì)照，且第3天為最大值。第5天出現(xiàn)最小值，此時(shí)處理間SOD酶活性差異較大，盆栽處理比空白對(duì)照處理的SOD酶活性降低了20.0%，田間處理比空白對(duì)照處理降低了2.0%。

2.1.5 對(duì)藜葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

由圖1e可以看出，PA-2噴施后，盆栽和田間處理組的PAL酶活性遠(yuǎn)低于對(duì)照組。在第1天3個(gè)處理的PAL酶活性基本接近。盆栽處理的PAL酶活性在第2天達(dá)到峰值，之后藜葉片內(nèi)PAL酶活性一直緩慢降低；田間處理組，藜葉片中PAL酶活性變化趨勢(shì)為先下降后上升再下降，在第5天時(shí)達(dá)到最大值。噴霧4 d時(shí)，各處理間差異較大，盆栽處理比空白對(duì)照處理的PAL酶活性降低了70.6%，田間處理比空白對(duì)照降低了48.7%。

2.1.6 對(duì)藜葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖1f可以看出，經(jīng)PA-2噴施后，盆栽處理和田間處理的藜葉片可溶性蛋白含量總體水平小于空白對(duì)照。在第2天和第4天，盆栽與田間試驗(yàn)均出現(xiàn)谷值，且第6天，田間處理蛋白質(zhì)谷值出現(xiàn)最大值，此時(shí)可溶性蛋白差異較大，盆栽處理比對(duì)照的可溶性蛋白含量降低了76.2%，田間處理比對(duì)照降低了36.4%。

2.1.7 對(duì)藜葉片可溶性糖含量的影響

由圖1g可以看出，經(jīng)PA-2噴施后，盆栽處理的可溶性糖含量總體水平低于田間處理和空白對(duì)照，且呈下降趨勢(shì)。經(jīng)PA-2噴施2 d后盆栽處理及田間處理的藜葉片中，可溶性糖含量下降速率最大，盆栽處理比空白對(duì)照處理的可溶性糖含量降低了54.0%，田間處理比空白對(duì)照處理降低了49.6%。

2.1.8 對(duì)藜葉片葉綠素含量的影響

由圖1h可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，盆栽試驗(yàn)與田間試驗(yàn)中藜葉片葉綠素含量整體呈持續(xù)下降趨勢(shì)，且均低于對(duì)照，葉綠素降低的速率為盆栽試驗(yàn)>田間試驗(yàn)。尤其是盆栽試驗(yàn)中，4 d后，葉綠素含量下降速率明顯加快。在第7天時(shí)，盆栽處理比空白對(duì)照處理的葉綠素含量降低了54.9%，田間處理比空白對(duì)照處理降低了11.9%。

圖1 出芽短梗霉菌PA-2不同時(shí)間脅迫下藜葉片丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物岐化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性以及可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、葉綠素的含量變化

2.2 出芽短梗霉菌PA-2粗提物對(duì)藜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

觀察各時(shí)間點(diǎn)葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化情況(圖2)。在無菌水處理的藜葉片中，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有完整的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等細(xì)胞器比較清晰。葉綠體呈梭形態(tài)，整齊的黏附在細(xì)胞質(zhì)膜上，具有清晰完整雙層膜結(jié)構(gòu)，含有一些淀粉粒和嗜鋨體；線粒體呈圓球狀，結(jié)構(gòu)完整的排列在葉綠體的周邊；具有清晰可見的核膜核仁(圖2A和圖2B)。噴施PA-2發(fā)酵液的第1天后，葉綠體呈現(xiàn)腫脹，其內(nèi)的一些嗜鋨體葉呈現(xiàn)腫脹，葉綠體中淀粉粒也出現(xiàn)體積增大及數(shù)量增多的現(xiàn)象，而線粒體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化(圖2C和圖2D)。經(jīng)PA-2噴施2 d后，葉綠體腫脹變形加重，不再黏附細(xì)胞質(zhì)膜，在胞內(nèi)呈現(xiàn)雜亂無序的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)具有一些淀粉粒，部分葉綠體呈現(xiàn)中空現(xiàn)象；而線粒體結(jié)構(gòu)無明顯變化(圖2E和圖2F)。PA-2噴施3 d后，葉綠體已被損傷至無完整的形狀，外膜發(fā)生解體并分布有很多淀粉粒，線粒體結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)腫脹(圖2G和圖2H)。

A和B：對(duì)照葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；C和D：24 h葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；E和F：48 h葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；G和H：72 h葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；CH：葉綠體；M：線粒體；CW：細(xì)胞壁；OG：嗜鋨體；S：淀粉粒；V：液泡；N：細(xì)胞核；PM：質(zhì)膜

3 討論與結(jié)論

在具有除草效果的生防制劑脅迫后，植株主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：器官結(jié)構(gòu)改變，能量供應(yīng)和色素合成和生長(zhǎng)繁殖受影響等[21]，其中以影響葉綠體的功能為主[29]。本研究采用PA-2菌株發(fā)酵液噴霧處理藜葉片后，發(fā)現(xiàn)藜葉片中丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶活性、可溶性糖及蛋白質(zhì)含量等相關(guān)的生理指標(biāo)都發(fā)生改變，其中比較明顯的是，葉綠素含量的顯著下降。同時(shí)通過觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在PA-2侵染后，藜葉片葉綠體發(fā)生腫脹，一些葉綠體發(fā)生解體現(xiàn)象，推測(cè)PA-2可能通過嚴(yán)重影響藜葉片正常的光合作用來抑制其生長(zhǎng)。丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量變化可以反映植物遭受逆境傷害的程度[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，在盆栽和田間試驗(yàn)中，藜葉片中的MDA含量呈現(xiàn)先升后降，第6天接近對(duì)照，說明在PA-2菌株粗提物處理初期，細(xì)胞膜受到了一定的損害，隨著時(shí)間推移，植物細(xì)胞膜通過抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用緩解了部分損傷[31]。田間試驗(yàn)與盆栽試驗(yàn)于第2天、第4天MDA含量均有峰值出現(xiàn)，且田間試驗(yàn)中，在MDA含量增加時(shí)，SOD含量均明顯增加；同樣在盆栽試驗(yàn)中，MDA含量達(dá)最高值時(shí)，CAT與POD含量均達(dá)最大值。SOD、POD和CAT是細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基的酶促保護(hù)系統(tǒng)中重要組成，植物體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)，能有效清除O2-等活性氧自由基[32]；POD在植物的逆境中可能更多起著協(xié)同補(bǔ)充的作用[33]，CAT對(duì)清除ROS發(fā)揮著重要作用[34]。三者之間的協(xié)調(diào)能使植物體內(nèi)活性氧自由基維持在較低的水平，避免損害生物膜[35]。由此可知，抗氧化酶代謝系統(tǒng)參與了PA-2發(fā)酵液脅迫藜葉片時(shí)的防衛(wèi)反應(yīng)。

從PAL含量變化曲線中可以看出，無論是田間還是盆栽試驗(yàn)，PAL含量總體水平下降，而PAL活性與酚類物質(zhì)的合成有著密切的聯(lián)系[36]，它是莽草酸途徑的限速酶，由該途徑合成的中間產(chǎn)物都是植物體內(nèi)一些重要的抗菌物質(zhì)，如酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素等[37]，本研究中PAL活性降低，一定程度上說明了藜植株酚類物質(zhì)的合成受阻?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴桥c對(duì)照相比總體含量下降，說明PA-2發(fā)酵液影響了可溶性蛋白和可溶性糖的合成。另外，植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)的基礎(chǔ)是線粒體的活動(dòng)[35]，在PA-2發(fā)酵液處理的第3天超微結(jié)構(gòu)圖中可以觀察到線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生腫脹，說明藜受出芽短梗霉菌PA-2發(fā)酵液脅迫后，線粒體也受到一定的影響。綜上所述，出芽短梗霉菌PA-2粗提物對(duì)雜草藜葉片的生理生化影響表現(xiàn)為以破壞葉綠素的功能為主，其次影響線粒體結(jié)構(gòu)，降低酚類物質(zhì)、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的合成。