文霄瑕 楊桂姝 祖瑞鈴 張開炯 廖鈺霖 李石 余思思 王東生 冷平 綜述 羅懷超 審校

惡性腫瘤嚴(yán)重危害全人類生命健康，根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）的預(yù)估，在172 個國家中，癌癥是其中91 個國家70 歲以下人群的第一或第二大死因[1]。根據(jù)臨床專家權(quán)威共識，早期篩查對癌癥診斷和治療具有重要意義，甚至能有效降低癌癥死亡率[2]。近年來，液體活檢因其可連續(xù)取樣、自動化完成以及結(jié)果可重復(fù)等優(yōu)勢被認(rèn)為是癌癥早期檢測和癌癥病程中的無創(chuàng)性腫瘤分析和監(jiān)測的重要工具[3]。其中研究較多的有ctDNA、CTCs、EVs 和TEPs等[4-5]，上述生物分子通常被認(rèn)為是原發(fā)性腫瘤的腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一部分。如CTCs 中包含著關(guān)于腫瘤形成及轉(zhuǎn)移、藥物敏感性和耐藥性等遺傳學(xué)信息[6]，而腫瘤患者血液中ctDNA 的致癌基因突變往往可以早于影像學(xué)診斷。因此，CTCs 及ctDNA 水平有助于研究早期腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及進(jìn)展，并監(jiān)測治療的效果[7]。此外，近年來大量研究表明，TEPs 可促進(jìn)腫瘤侵襲、遷徙和增殖，是腫瘤生長的全身和局部反應(yīng)的核心參與者[8-9]，盡管目前關(guān)于TEPs 形成機(jī)制尚未明確，但是相比于血液中其他生物分子，TEPs 含量豐富、容易分離、RNA 質(zhì)量相對更高以及其響應(yīng)外部信號處理RNA 的能力都更具優(yōu)勢[10]，使其在液體活檢中有著良好的應(yīng)用前景（圖1）。

1 腫瘤教化血小板

血小板是從人體骨髓中產(chǎn)生的循環(huán)外周血細(xì)胞，數(shù)量僅次于外周紅細(xì)胞，因其在止血和傷口愈合中的重要作用而被認(rèn)識。但是血小板一直是潛在癌癥診斷工具，簡單的血小板計數(shù)、血小板大小等就包含了大量臨床信息[11]。有研究通過分析富含血小板的血漿（platelet rich plasma，PRP）中的血小板參數(shù)，發(fā)現(xiàn)與正常個體相比，肺癌患者PRP 中的血小板平均體積（mean platelet volume，MPV）、血小板計數(shù)和血小板回收率（percentage platelet recovery，PPR）均存在顯著性差異[12]。血小板雖然是無核細(xì)胞，但其含有豐富的RNA，包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核仁小分子RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）等[10，13]。其中miRNA 所占比例最多，并且在血小板中發(fā)揮剪接和轉(zhuǎn)錄、調(diào)控誘導(dǎo)蛋白質(zhì)重組以及抑制血小板蛋白的表達(dá)等重要作用[14]。在血小板與腫瘤相互作用的病理生理過程中，腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境能夠通過不同信號分子間接或通過不同受體（如血小板活化受體P 選擇素）直接與血小板相互作用，從而改變血小板的RNA 信息及蛋白質(zhì)含量[15-16]，這種因腫瘤影響導(dǎo)致RNA 譜發(fā)生改變的血小板稱為腫瘤教化血小板（tumor-educated platelets，TEPs），見圖1。盡管目前導(dǎo)致TEPs 的RNA 譜表達(dá)發(fā)生改變的生物學(xué)機(jī)制尚缺乏準(zhǔn)確的定義，但是研究表明在腫瘤患者體內(nèi)，TEPs 的 RNA 譜表達(dá)受到病理生理?xiàng)l件的動態(tài)影響[17]，并且TEPs 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，包被CTC 使其逃避免疫機(jī)制[18]。由此可見TEPs 可作為加強(qiáng)腫瘤早期診斷，并促進(jìn)非侵入性腫瘤監(jiān)測前景的良好生物標(biāo)志物。

圖1 腫瘤教化血小板（TEPs）的形成途徑以及基于TEPs 的液體活檢的應(yīng)用研究進(jìn)展

2 基于TEPs 液體活檢的應(yīng)用

2.1 TEPS 可實(shí)現(xiàn)基于血液的腫瘤診斷

采集的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝全血（室溫儲存＜48 h）進(jìn)行120 g 離心20 min 后獲得PRP，再對PRP 進(jìn)行360 g離心20 min 獲得下層的濃縮血小板，測定血小板純度在每1 000 萬血小板中有核細(xì)胞＜5 個，提取血小板RNA 后通過測序手段定性定量分析血小板在特定狀態(tài)下的RNA 組成與含量信息，從而產(chǎn)生血小板的RNA 譜[10，16-17]。

Calverley 等[19]通過微陣列分析比較7 例健康供體和5 例從未治療的轉(zhuǎn)移性肺癌患者的血小板RNA 譜，發(fā)現(xiàn)200 個基因有顯著改變，其中197 個基因低表達(dá)，表明轉(zhuǎn)移性肺癌患者TEPs RNA 譜與健康成人有顯著區(qū)別，利用TEPs 可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)移性肺癌的預(yù)測。這項(xiàng)研究為后續(xù)基于TEPs RNA 進(jìn)行癌癥診斷奠定了基礎(chǔ)。2015年，Best 團(tuán)隊(duì)對55 例健康供體和228 例局部以及轉(zhuǎn)移癌癥患者，包括非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）、胰腺癌（pancreatic cancer，PAAD）、肝及膽管癌（hepatobiliary cancer，HBC）和乳腺癌（breast cancer，BrCa）血小板進(jìn)行廣泛的RNA 測序，發(fā)現(xiàn)了癌癥患者的TEPs 中存在5 003 個不同表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼和非編碼RNA，通過對這些RNA 進(jìn)行已知的血小板標(biāo)記物的鑒定，結(jié)果顯示有1 453 個mRNAs 高表達(dá)，793 個mRNAs 低表達(dá)。根據(jù)這些差異RNA 開發(fā)了一種算法鑒別癌癥患者與正常人群，準(zhǔn)確率可達(dá)到96%[17]。

2017年，Best 團(tuán)隊(duì)再次應(yīng)用 TEPs 對NSCLC 進(jìn)行了后續(xù)更深入研究，納入了不同分期的NSCLC 患者，還包含了對年齡、吸煙習(xí)慣、炎癥狀態(tài)的分析，并將血小板分離時間標(biāo)準(zhǔn)化以及利用粒子群優(yōu)化（particle swarm optimazation，PSO）增強(qiáng)算法從血小板RNA 測序文庫中選擇了最佳的TEPs RNA 生物標(biāo)志物集，通過TEPs RNA 譜的差異將245 例Ⅳ期晚期NSCLC 患者和273 例健康受試者正確區(qū)分，準(zhǔn)確率為89%，將53 例Ⅰ～Ⅲ期的NSCLC 患者和53 例健康受試者正確區(qū)分，準(zhǔn)確率為 81%。其準(zhǔn)確性隨樣本量增加而提高且不受個體的年齡、吸煙習(xí)慣、全血儲存時間和各種炎癥的影響[20]。這些結(jié)果證實(shí)TEPs不僅可以診斷肺癌還可以區(qū)分不同分期的肺癌。近期, 有研究對7 例健康個體和15 例NSCLC 患者的血小板同樣進(jìn)行了RNA-seq 檢測，同時增加對NSCLC亞組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄比較分析，結(jié)果顯示肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌亞組的TEPs RNA 譜也存在的顯著性差異[21]，通過TEPs RNA 譜的差異可以將肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌區(qū)分，表明利用TEPs RNA 譜的改變診斷不同病理類型的肺癌具有一定前景。由于大部分肺癌早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，患者往往錯失最佳治療時機(jī)，導(dǎo)致肺癌成為全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因[12]。近年來，利用基于TEPs 的液體活檢對肺癌進(jìn)行早期診斷以及分型診斷的研究發(fā)展迅速，開展的臨床研究也不斷取得可喜的成果，為肺癌早期診斷及減少死亡率提供了更多方案。

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌。目前，主要診斷方式為結(jié)腸鏡檢測，但是使用結(jié)腸鏡檢查成本高，容易引起腸道不適以及并發(fā)癥[22]，因此血液標(biāo)志物用于結(jié)腸癌檢測更容易被患者接受。自Best 等[17]研究發(fā)現(xiàn)利用TEPsRNA 譜可實(shí)現(xiàn)區(qū)分健康供者和癌癥患者從而可以對多種癌癥診斷提供更無創(chuàng)安全的方案后，Yang 等[22]通過進(jìn)一步分析44 例結(jié)直腸癌患者和55 例健康成人發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸患者TEPsRNA 中1 099 個不同的血小板表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGS），包括824 個高表達(dá)的DEGS 和275 個低表達(dá)的DEGS，使用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測后顯示來自結(jié)腸癌患者血小板中的金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）水平顯著高于健康個體、潰瘍性結(jié)腸炎患者和克羅恩病患者，再次驗(yàn)證了通過結(jié)腸癌患者TEPsRNA 譜表達(dá)改變對結(jié)腸癌進(jìn)行診斷的可行性，推動了利用基于TEPs 的液體活檢對診斷結(jié)腸癌的研究進(jìn)展。

除此之外，利用TEPs RNA 譜在肉瘤診斷中也取得一定進(jìn)展。一項(xiàng)研究通過對57 例活動性肉瘤患者、38 例3年內(nèi)無復(fù)發(fā)的曾患肉瘤的患者和65 例健康成人的TEPs RNA 譜進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示活動性肉瘤患者的TEPs RNA 譜中有2 537 個RNA 發(fā)生顯著改變，利用TEPsRNA 譜的不同既可區(qū)分健康成人，也可區(qū)分已經(jīng)恢復(fù)并且無復(fù)發(fā)的肉瘤患者[23]。肉瘤是起源于間葉組織（包括結(jié)締組織和肌肉）的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率高，目前尚未發(fā)現(xiàn)血液中的生物標(biāo)志物可用于肉瘤的早期診斷。盡管該項(xiàng)利用TEPs RNA 進(jìn)行肉瘤診斷的研究樣本量較小，但是可以發(fā)現(xiàn)TEPs 作為肉瘤早期診斷的新型血液生物標(biāo)志物的巨大潛力，而基于TEPs 的液體活檢方式也有望成為肉瘤早期診斷的輔助方式。

基于TEPs RNA 譜的改變對乳腺癌的診斷具有一定潛力，利用替代TEPs RNA 譜可實(shí)現(xiàn)區(qū)分HER-2、PIK3CA 突變體或三陰性乳腺癌[17]。Yao 等[24]開展了更大規(guī)模的研究，對549 例未經(jīng)任何治療的BrCa 患者和154 例年齡匹配的健康志愿者的血小板RNA 進(jìn)行高通量測序qRT-PCR，并對基因表達(dá)特征進(jìn)行了表征。在BrCa 患者和健康志愿者之間共鑒定了138 個上調(diào)基因mRNAs 和18 個下調(diào)基因mRNAs，證實(shí)通過TEPsRNA 譜的改變可以實(shí)現(xiàn)區(qū)分乳腺癌患者和健康志愿者。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在國內(nèi)發(fā)病率僅次于宮頸癌。上述研究結(jié)果為利用TEPs 進(jìn)行乳腺癌的早期診斷研究提供了更有力的依據(jù)。

2.2 基于TEPs 液體活檢在癌癥監(jiān)測中的應(yīng)用

近年來，隨著對基于TEPs 的液體活檢更為深入的研究，發(fā)現(xiàn)利用TEPs 不僅可以診斷癌癥發(fā)生，在癌癥發(fā)展監(jiān)測也有一定發(fā)展前景。Nillson 等[25]在NSCLC 患者的TEPs 分離的腫瘤來源RNA 分子中檢測出促使肺腺癌發(fā)生發(fā)展的EML4-ALK 融合基因，準(zhǔn)確率為86%，對NSCLC 患者進(jìn)行抗EML4-ALK藥物克唑替尼治療后，再次檢測結(jié)果顯示出循環(huán)TEPs 中EML4-ALK 融合基因的數(shù)量減少，正常血小板生命周期僅7～10 天，腫瘤的轉(zhuǎn)錄組可以在TEPs中積累，并且不受循環(huán)血漿中RNA 的干擾。因此，TEPs RNA 分析可揭示肺癌活動的最新、增強(qiáng)和動態(tài)反映。利用成像模式監(jiān)測治療反應(yīng)，假陽性腫瘤進(jìn)展仍然是一個無法避免的難題，但是Sol 等[26]的研究通過使用TEPs RNA 特征，可有效區(qū)分假陽性的腦膠質(zhì)瘤患者和真正腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展的患者。Yang 等[22]研究中提到TEPs 中的TIMP1 在血小板與結(jié)腸癌細(xì)胞相互作用過程中能夠被攜帶進(jìn)入到結(jié)直腸癌細(xì)胞中，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖發(fā)展。利用基于TEPs 的液體活檢技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)對結(jié)直腸癌的早期診斷，還可以將TEPs RNA 中的TIMP1 作為結(jié)直腸癌不同發(fā)展階段的潛在標(biāo)志物監(jiān)測結(jié)直腸癌的活動與病程發(fā)展。此外，研究顯示BrCa 患者TEPs 中肌球蛋白3（TPM3）mRNA 的表達(dá)明顯升高，并且可通過微囊泡被傳遞到BrCa 細(xì)胞中導(dǎo)致BrCa 細(xì)胞遷移表型增強(qiáng)，與BrCa早期轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[24]。局限性BrCa 的女性5年相對生存率為99%，而轉(zhuǎn)移的患者則下降至7%，根據(jù)TEPs 中TPM3 mRNA 的表達(dá)水平來監(jiān)測乳腺癌是否有轉(zhuǎn)移，有效降低了女性因未及時監(jiān)測到乳腺癌轉(zhuǎn)移從而引發(fā)死亡的概率。

3 結(jié)語與展望

隨著近年來分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)于液體活檢的研究也顯著增加，使液體活檢技術(shù)取得快速發(fā)展。液體活檢作為精準(zhǔn)醫(yī)療的新技術(shù)在腫瘤發(fā)生檢測以及腫瘤發(fā)展監(jiān)測及預(yù)后評估中具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢和廣泛的臨床應(yīng)用價值。利用TEPs 開展癌癥的檢測與監(jiān)測的各種研究，擴(kuò)充了液體活檢的途徑，使基于TEPs 的液體活檢越來越受到各方認(rèn)可。但是目前基于TEPs 的液體活檢的臨床研究依舊具有一定局限性，包括樣本量小、試驗(yàn)條件不夠標(biāo)準(zhǔn)化等，未來的臨床驗(yàn)證研究需要在大樣本的隊(duì)列中進(jìn)行，并且應(yīng)將樣本采集流程及儲存條件標(biāo)準(zhǔn)化以及將腫瘤患者及健康供者可能影響研究結(jié)果準(zhǔn)確性的潛在變量（年齡、性別、生活習(xí)慣等）相匹配后再進(jìn)行對比，最終確認(rèn)基于TEPs 的液體活檢的臨床應(yīng)用價值。另外，未來研究也應(yīng)注重闡明TEPs 對腫瘤發(fā)生發(fā)展的相互作用機(jī)制，為基于TEPs 的液體活檢研究帶來希望。