張彥春，楊 波，王 苗，冀國強(qiáng)，馬紅梅，李 穎，張茂俊

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)可導(dǎo)致耶爾森菌病[1-2]，廣泛分布于自然界，是少數(shù)幾種能在冷藏溫度下生長的腸道致病菌之一，該菌天然寄居在多種動物體內(nèi)，通過污染食物(牛奶、豬肉等)和水經(jīng)糞-口途徑感染或因接觸染疫動物而感染[3-5]。Y.enterocolitica的毒力基因主要有5種，其中包括染色體源毒力基因ail、ystA、ystB和質(zhì)粒源毒力基因yadA、virF，與人腹瀉密切相關(guān)[6]。Y.enterocolitica嗜冷，因此歐洲高緯度國家耶爾森菌病流行強(qiáng)度較高[3-5]。北京雖處于溫帶地區(qū)，但冬季時(shí)間長且氣溫低，極有可能具備Y.enterocolitica流行的先決條件。

因體外培養(yǎng)Y.enterocolitica菌落小且菌落特征不典型，造成實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)Y.enterocolitica難度增加，通常需要經(jīng)驗(yàn)豐富技術(shù)人員的仔細(xì)甄別，容易造成菌落遺漏和錯(cuò)誤識別。本研究對70份零售生豬肉樣品進(jìn)行Y.enterocolitica檢測，為提高分離培養(yǎng)陽性率，本研究在傳統(tǒng)增菌分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上增加了對增菌液進(jìn)行Y.enterocolitica特異基因熒光PCR預(yù)篩查檢測，旨在準(zhǔn)確獲得本地區(qū)零售生豬肉中Y.enterocolitica分布及病原特征。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源 采集來自北京順義區(qū)超市和小型市場零售攤位的生豬肉樣品，采樣時(shí)間2019年3月至2020年10月，共計(jì)70件。樣品采集后4 ℃暫存，2 h內(nèi)送入順義區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.1.2 主要儀器與試劑 耶爾森選擇培養(yǎng)基為美國OXOID公司產(chǎn)品；改良磷酸鹽緩沖液(PSB)、胰酪大豆瓊脂(TSA)、改良克氏雙糖鐵(KIA)為北京陸橋公司產(chǎn)品；脈沖場凝膠電泳試驗(yàn)使用的Tris-Hcl、EDTA、SDS、TBE、蛋白酶K為索萊寶公司產(chǎn)品；NotI、XbaI內(nèi)切酶為美國NEB公司產(chǎn)品；傳統(tǒng)PCR反應(yīng)液(Premix TaqTMVersion 2.0)為TaKaRa公司產(chǎn)品；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌熒光PCR檢測試劑盒(foxA基因)為北京卓成惠生公司產(chǎn)品(A2160)；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌多重?zé)晒釶CR鑒定及毒力基因分型檢測試劑盒為青島中創(chuàng)匯科生物制品有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(美國伯樂CFX96 Tough型)，脈沖場凝膠電泳儀(美國伯樂CHEF Mapper)、細(xì)菌鑒定儀(法國梅里埃公司VITEK 2 compact)。

1.2 方 法

1.2.1Y.enterocolitica分離培養(yǎng) 將25 g生豬肉樣本加入225 mL改良磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行4 ℃冷增菌，時(shí)間為20 d。用10 μL 接種環(huán)取1環(huán)增菌液接種耶爾森選擇培養(yǎng)基26 ℃培養(yǎng)48 h，Y.enterocolitica可疑菌落中央深紅色且周圍具有無色透明圈。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)》(GB4789.8-2016)中分離培養(yǎng)步驟，挑取5個(gè)可疑單菌落接種改良克氏雙糖鐵瓊脂，然后挑取培養(yǎng)物進(jìn)行foxA基因熒光PCR檢測，foxA基因陽性菌落轉(zhuǎn)種TSA平板26 ℃純培養(yǎng)24 h，純培養(yǎng)菌落使用全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定。

1.2.2 增菌液熒光PCR預(yù)篩查檢測 改良磷酸鹽緩沖液冷增菌20 d后吸取200 μL至EP管中，100 ℃金屬浴加熱10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清作為模板進(jìn)行foxA基因熒光PCR預(yù)篩查檢測。若增菌液熒光PCR篩查foxA基因陽性而Y.enterocolitica培養(yǎng)陰性，則將增菌液重新接種耶爾森選擇培養(yǎng)基26 ℃培養(yǎng)48 h，挑取更多可疑單菌落進(jìn)行foxA基因熒光PCR檢測，直至挑取到foxA基因陽性單菌落，然后純化培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

1.2.3 分離株毒力基因、分子分型和抗生素敏感性檢測 將生豬肉中分離的Y.enterocolitica陽性菌株和本地區(qū)2017-2019年腹瀉病例中分離的3個(gè)Y.enterocolitica菌株進(jìn)行毒力基因(ail、ystA、ystB、yadA、virF)普通PCR檢測[6]、毒力基因熒光PCR檢測(小腸結(jié)腸炎耶爾森菌多重?zé)晒釶CR鑒定及毒力基因分型檢測試劑盒)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型檢測[7]和抗生素敏感性試驗(yàn)(上海星佰革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，D板)。PFGE指紋圖譜(NotI酶切)上傳國家致病菌識別網(wǎng)進(jìn)行比對分析。耐藥、中介、敏感的判定依據(jù)為CLSI M100-S28?？股匕ㄇ嗝顾仡悾喊逼S西林(Ampicillin, AMP)、氨芐西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam, AMS)；一代頭孢：頭孢唑林(Cefazoin, CFZ)；二代頭孢：頭孢西丁(Cefoxitin, CFX)；三代頭孢：頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime, CTX)；碳青霉烯類：亞胺培南(Imipenem, IMP)；大環(huán)內(nèi)酯類：阿奇霉素(Azithromycin, AZM)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline，TET)；喹諾酮/氟喹諾酮類：萘啶酸(Nudic Acid, NAL)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)；氯霉素類：氯霉素(Chloramphenicol, CHL)；氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin, GEN)；磺胺類：復(fù)方磺胺(Trimeth-sulfame, SXT)；測試抗生素共包括7大類14種(青霉素類、頭孢類和碳青霉烯類均歸為β內(nèi)酰胺類)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離情況 70份樣品中，6份使用傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)法Y.enterocolitica分離培養(yǎng)陽性，陽性率8.57%(6/70)；19份增菌液foxA基因熒光PCR預(yù)篩查檢測陽性(6份傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)法陽性樣本均包含在內(nèi))，陽性率27.14%(19/70)；13份增菌液foxA基因預(yù)篩查檢測陽性，但Y.enterocolitica分離培養(yǎng)陰性樣品通過增加挑取可疑菌落數(shù)量(20～50個(gè)單菌落)的方式最終均成功分離到菌株。4個(gè)季節(jié)樣本檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.390，P值=0.222)；超市和市場零售樣本檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.031，P=0.860)；北京市來源和外省市來源肉品檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.802，P=0.005)，見表1。

表1 Y. enterocolitica陽性分離率分布Tab.1 Distribution of isolation rate of Y. enterocolitica isolates

2.2 菌株毒素檢測結(jié)果和抗生素敏感性檢測結(jié)果 19株分離自生豬肉的Y.enterocolitica對15種抗生素耐藥率由高至低依次為CFZ：94.74%(18/19)，AMP：84.21%(16/19)，CFX：47.39%(9/19)，AMS：42.11%(8/19)，NAL：15.79%(3/19)，CIP：5.26%(1/19)，TET：5.26%(1/19)，CAZ：5.26%(1/19)，優(yōu)勢耐藥譜為AMP+CFZ聯(lián)合耐藥，耐藥譜見表2。2種方法(傳統(tǒng)PCR和多重?zé)晒釶CR)檢測19株生豬肉分離株5種毒力基因結(jié)果具有一致性，且19株Y.enterocolitica攜帶毒力基因特征均為ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-；2種方法檢測北京順義地區(qū)2017-2019年腹瀉病例中分離到3株Y.enterocolitica5種毒力基因結(jié)果也具有一致性，見表2。

表2 Y. enterocolitica耐藥譜和毒力基因分布Tab.2 Antibiotic resistance spectrum and virulence gene distribution of Y. enterocolitica isolates

2.3 菌株分子分型結(jié)果 19株Y.enterocolitica全部進(jìn)行PFGE分子分型檢測，其中2株條帶降解，其余17株成功獲得PFGE指紋圖譜。17株Y.enterocolitica與國家致病菌識別網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中北京順義地區(qū)曾上傳的3個(gè)病例株(BJSY2017Ye001、BJSY2018Ye001、BJSY2019Ye001)進(jìn)行聚類分析，其中Yes-2019bjsy004和Yes-2019bjsy025為不同采樣時(shí)間、不同采樣地點(diǎn)、但卻是同一食品加工企業(yè)生產(chǎn)的2份生豬肉樣品所分離，菌株帶型一致；Yes-2020bjsy031和Yes-2020bjsy032為同一市場、同一攤位采集的2份生豬肉樣品所分離，分離菌株帶型一致；Yes-2019bjsy(ZC)003和Yes-2019bjsy(ZC)004也為同一市場、同一攤位采集的2份生豬肉樣品所分離，菌株帶型相似程度為95.74%。其余11個(gè)菌株帶型相似程度低，呈分散分布，與本地區(qū)病例分離株不成簇。見圖1。

圖1 自生肉和病例分離Y. enterocolitica脈沖場凝膠電泳聚類結(jié)果Fig.1 PFGE pattern cluster analysis of Y. enterocolitica isolates from raw meat and patients with diarrhea

3 討 論

歐洲的相關(guān)研究中，Y.enterocolitica在生鮮制品的檢出率超過30%[8]，但國內(nèi)部分研究，生鮮制品中Y.enterocolitica檢出率僅有10%，甚至低于5%[9-11]。本研究使用傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)法Y.enterocolitica陽性率為8.5%(6/70)，而增菌液foxA基因熒光PCR預(yù)篩查陽性率為27.14%(19/70)。增菌液foxA基因預(yù)篩查陽性而培養(yǎng)法陰性的樣品，在增加了從選擇性培養(yǎng)基中挑取可疑菌落的數(shù)量后(20～50個(gè)單菌落)，最終全部成功分離到Y(jié).enterocolitica菌株，說明增菌培養(yǎng)法存在因挑取可疑菌落數(shù)不足而造成漏檢的問題，結(jié)合增菌液熒光PCR預(yù)篩查檢測，可顯著提高生豬肉樣品中Y.enterocolitica分離培養(yǎng)陽性率。本研究中發(fā)現(xiàn)4個(gè)季節(jié)Y.enterocolitica檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，超市與市場零售樣品檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但北京市肉源檢出率顯著高于外省市肉源，這可能是北京市肉源相對外省市肉源的銷售周期短，肉制品新鮮程度高相關(guān)。

本研究中對17株生肉分離株和本地區(qū)2017-2019年3株病例分離株進(jìn)行了分子分型分析，結(jié)果顯示Y.enterocolitica帶型多樣化，無顯著遺傳聚集性特征，且生肉分離株與病例分離株帶型的相似程度低。生豬肉樣品分離Y.enterocolitica遺傳相似程度與食品生產(chǎn)同源性或銷售同源性是否相關(guān)，值得在以后的監(jiān)測中深入研究。

缺少ystA、ail、yadA基因而僅攜帶耐熱性腸毒素B基因(ystB)的Y.enterocolitica菌株無法突破宿主免疫造成感染[12]，本次生豬肉樣品中分離19株菌毒力基因攜帶特征均為ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-，是非致病生物1A型Y.enterocolitica最常見的毒力基因攜帶特征[12-13]，用Y.enterocolitica菌種水平識別來評估食品的致病風(fēng)險(xiǎn)存在一定局限，增加ail、ystA、yadA等毒力基因檢測，對提升Y.enterocolitica食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測具有一定意義。菌株毒力基因的熒光PCR組合檢測可快速獲得分離菌株的毒力特征，值得廣泛推廣。

本研究中Y.enterocolitica對青霉素類(氨芐西林)和一代頭孢(頭孢唑林)耐藥率較高，與國內(nèi)類似研究結(jié)果相似[14-16]。王聞卿等報(bào)道上海食源性Y.enterocolitica分離株對三代頭孢、氟喹諾酮等抗生素均敏感[14]；本研究中出現(xiàn)耐三代頭孢(頭孢他啶)菌株和耐氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星)Y.enterocolitica各1株，耐喹諾酮類(萘啶酸)Y.enterocolitica3株，且北京市順義區(qū)2017和2019年均分離到同時(shí)耐頭孢他啶、萘啶酸和環(huán)丙沙星的病例株，2017年病例株同時(shí)耐碳青霉烯類抗生素(亞胺培南)；三代頭孢、喹諾酮/氟喹諾酮類、碳青霉烯類等臨床常用抗生素對Y.enterocolitica感染的治療效果可能會降低[16]。Y.enterocolitica對三代頭孢、喹諾酮/氟喹諾酮類、碳青霉烯類抗生素的耐藥進(jìn)展應(yīng)引起臨床、畜牧、公共衛(wèi)生等部門的關(guān)注，應(yīng)加強(qiáng)Y.enterocolitica耐藥表型及耐藥基因相關(guān)監(jiān)測工作。