安雅婷，楊新建，張善革，付彬，李學(xué)林，王雷

(1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300120；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000)

1 儀器與試藥

1.1儀器 YJD20D-GL十功能自動煎藥機(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)，YB50-250B中藥湯劑包裝機(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)，GH802-1A凈化工作臺(天津市泰斯特儀器有限公司)，HTY-2000B型HTY型集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)，SHP-200B型生化培養(yǎng)箱(天津市天宇實驗儀器有限公司)，HHB11420型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市實驗儀器廠)，MS105DU型萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.1 mg)，AS-3120超聲波清洗器(天津市奧特賽恩斯儀器有限公司)，YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器(山東安得醫(yī)療科技有限公司)，量瓶，量筒(F=1.000 0)。

1.2試藥 中藥飲片均購于安徽省亳州市中藥飲片廠，經(jīng)天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院長征醫(yī)院制劑室檢驗合格；中藥湯劑(天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院煎藥室制備，規(guī)格：每袋200 mL)；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：151016)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：150919)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：151028)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：1511062)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：151026)均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1待測中藥湯劑的制備

2.1.1煎煮 按照本院煎藥室煎藥機煎煮操作規(guī)程進(jìn)行煎煮。一煎加水浸過藥面2～5 cm(先行浸泡≥30 min)，煎煮時，先用武火加熱達(dá)到沸騰，再改用文火慢煎，并保持微沸，煎煮至規(guī)定時間(≥30 min)。解表類、清熱類、芳香類藥物不宜久煎，煮沸后再煎(<30 min)；滋補類藥物先用武火煮沸，改用文火慢煎(>30 min)。二煎加水量少于一煎加水量，或根據(jù)預(yù)期得液量、二煎吸水量及二煎過程中的藥液損耗計算加水量。先用武火加熱達(dá)沸騰，再改用文火煎煮，并保持微沸煎煮至規(guī)定時間。一般第二煎煎煮時間比第一煎時間略短(≥20 min)。

2.1.2包裝 二煎煎煮完成之后，將二煎藥液與一煎藥液混合，并使混合后的藥液沸騰，采用中藥湯劑包裝機包裝。

2.1.3貯存方式 分別采用冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存和室溫避光(20±5 ℃)儲存，均儲存21 d。

2.2制備湯劑所用處方 選擇本院制劑室現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)且微生物限度檢驗方法已經(jīng)天津市藥品檢驗研究院或區(qū)藥品檢驗所驗證的32個制劑處方作為研究對象，處方組成見表1。按其功能主治主要分為兩類，處方1-23主要具有清熱、祛濕等作用；處方24-32主要具有益氣、養(yǎng)陰等作用。處方29-30含有非植物類飲片。

表1 32個制劑處方組成

2.3微生物限度檢驗方法及結(jié)果

2.3.1微生物限度檢驗方法 《中華人民共和國藥典》2020年版四部0181合劑項[1]規(guī)定，非無菌產(chǎn)品微生物限度(《中華人民共和國藥典》2020年版四部 1105，1106，1107)檢查：口服給藥液體制劑每毫升需氧菌數(shù)不得大于200 cfu· mL-1，霉菌和酵母菌數(shù)不得大于20 cfu· mL-1，不得檢出大腸埃希菌(控制菌)。由于中藥煎煮液處方復(fù)雜，其成分可能對微生物培養(yǎng)有干擾作用，因此按《中華人民共和國藥典》2020年版微生物限度檢查法薄膜過濾法[1]進(jìn)行檢測。取各組中藥煎煮液2份，充分混勻，立即吸取樣品溶液10 mL，加pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液稀釋至100 mL，得1：10供試液，置渦旋振蕩器上充分混勻1 min，靜置，取上清液10 mL加入無菌濾筒，用pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液沖洗3次，每次100 mL，抽濾。取出濾膜，菌面朝上貼于培養(yǎng)基平板上在培養(yǎng)箱培養(yǎng)；以pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液為空白對照，同法檢測。另取1：10供試液10 mL，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL進(jìn)行大腸埃希菌檢查；取pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液作為空白對照，同法檢測。以該處方制成湯劑并包裝完成為第0天，分別于第0，1，3，7，14，21天進(jìn)行性狀觀察和微生物限度檢測。

逃學(xué)失敗被家中或?qū)W校任何一方面發(fā)覺時，兩方面總得各挨一頓打。在學(xué)校得自己把板凳搬到孔夫子牌位前，伏在上面受笞。處罰過后還要對孔夫子牌位作一揖，表示懺悔。有時又常常罰跪至一根香時間。我一面被處罰跪在房中的一隅，一面便記著各種事情，此時想象恰如生了一對翅膀，憑經(jīng)驗飛到各樣動人事物上去。按照天氣寒暖，想到河中的鱖魚被釣起離水以后拔刺的情形，想到天上飛滿風(fēng)箏的情形，想到空山中歌呼的黃鸝，想到樹木上累累的果實。我應(yīng)感謝那種處罰，使我無法同自然接近時，給我一個練習(xí)想象力的機會。

2.3.2微生物限度檢測結(jié)果

(1)各組代煎湯劑性狀。分別于第0，1，3，7，14，21天，隨機抽取“2.1”項每組代煎湯劑各2份，肉眼觀察湯劑是否有變色、結(jié)塊等性狀變化。冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存和室溫避光(20±5 ℃)儲存的代煎湯劑從第3天開始，在煎藥袋底部逐漸有絮狀沉淀出現(xiàn)，含有動物類中藥飲片的代煎湯劑(如處方30：炒僵蠶)，與其他湯劑比較沉淀較多，但輕輕搖晃煎藥袋，可使之重新混懸，無結(jié)塊產(chǎn)生，無顏色變化。

(2)各組代煎湯劑微生物限度檢驗結(jié)果。分別于第0，1，3，7，14，21天隨機抽取“2.1”項每組代煎湯劑各2份，行微生物限度檢驗，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部0181合劑[1]規(guī)定，及非無菌產(chǎn)品微生物限度(《中華人民共和國藥典》2020年版四部 1105，1106，1107)檢查，進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，及控制菌(大腸埃希菌)檢查。結(jié)果見表2，3。表2為冰箱冷藏室(2～8 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結(jié)果，表3為室溫避光(20±5 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結(jié)果。

表2 冰箱冷藏室(2～8 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結(jié)果

表3 室溫避光(20±5 ℃)各組湯劑微生物限度檢測結(jié)果

隨儲存時間延長，在兩種貯藏條件下，各組代煎湯劑均未檢出控制菌。置于冰箱冷藏室(2～8 ℃)的代煎湯劑在隨機抽檢的第0，1，3，7天均未檢測出需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌。在隨機抽檢第14天，有18組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有29組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內(nèi)。在隨機抽檢第21天，有28組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有30組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內(nèi)。隨著儲存時間延長，冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存的代煎湯劑，第21天抽檢樣品中檢出需氧菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)均高于第14天的抽檢樣品，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。室溫避光(20±5 ℃)儲存的代煎湯劑在隨機抽檢第0，1，3天均未檢測出需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌。隨機抽檢第7天，有7組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內(nèi)。在隨機抽檢第14天有29組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有28組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范圍內(nèi)。在隨機抽檢的第21天，有29組代煎湯劑檢出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有32組代煎湯劑檢出霉菌和酵母菌，其中27組含量≤20 cfu·mL-1，在合格范圍內(nèi)；有5組霉菌和酵母菌含量>20 cfu·mL-1，微生物限度不合格。

①兩類湯劑間微生物限度比較：對清熱類湯劑和補益類湯劑的微生物進(jìn)行比較，采用SPSS22版軟件，運行獨立樣本t檢驗，均P>0.05，兩類代煎湯劑微生物數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

②相同取樣時間，不同貯藏條件比較：采用SPSS 22版軟件，運行配對樣本t檢驗。第14，21天，室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑中產(chǎn)生的需氧菌數(shù)量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存樣品，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第14天，室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑中的霉菌和酵母菌數(shù)量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存樣品，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第21天，室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑的霉菌和酵母菌數(shù)量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存樣品，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

③相同貯藏條件，不同取樣時間下比較：采用SPSS 22版軟件，運行配對樣本t檢驗。冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存代煎湯劑，第21天抽檢樣品中檢出需氧菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)均高于第14天抽檢樣品，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。室溫避光(20±5 ℃)儲存代煎湯劑，第21天抽檢樣品中檢出需氧菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)均高于第14天抽檢樣品，霉菌和酵母菌數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；需氧菌數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

整體看，隨著時間延長，各組代煎湯劑微生物有隨之增長趨勢，但各組代煎湯劑本身并無明顯規(guī)律。

3 討論

中藥湯劑在我國至今已有數(shù)千年應(yīng)用歷史，現(xiàn)代中藥湯劑質(zhì)量研究主要集中于煎煮過程控制對其成品煎液得量、密度、某些指標(biāo)性成分含量的影響方面。在對湯劑成品質(zhì)量的考察方面，隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，從考察處方中某些單一成分定量分析，到對中藥配方顆粒、經(jīng)典方湯劑、中成藥多成分、多靶點全面控制。但由于代煎中藥湯劑多為臨床醫(yī)生根據(jù)患者病情開具，一人一方，因此對代煎中藥湯劑的質(zhì)量控制研究困難重重。由于煎藥機及煎藥中心的發(fā)展，以及煎煮方法和器具使用等的諸多限制，患者多選擇代煎，中藥湯劑作為一種藥學(xué)延伸服務(wù)，應(yīng)該有其相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。已有研究表明，煎藥室通風(fēng)情況良好可減少交叉污染，操作環(huán)境干凈整潔可減少次生污染，保障煎藥設(shè)備、用具、潔具等的清潔到位可減少交叉污染或次生污染，盡量減少包裝材料材質(zhì)、儲藏和使用過程中引入污染，以及操作人員嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，都會對代煎中藥湯劑微生物限度產(chǎn)生影響[2]。而2020年版《中華人民共和國藥典》編制過程中，雖然對中藥飲片進(jìn)行微生物限度檢驗征求過意見，但由于實際情況所限，并未收載需煎煮飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。本研究依托國家重點研發(fā)計劃項目“中藥飲片智能調(diào)劑與煎煮設(shè)備關(guān)鍵技術(shù)研究”，建立“中藥湯劑煎煮技術(shù)規(guī)范”，從同質(zhì)煎藥流程及方法、提高代煎湯劑質(zhì)量、保護(hù)患者健康、降低用藥風(fēng)險等方面入手，對代煎中藥湯劑微生物限度進(jìn)行研究。

由于臨床中藥處方組方復(fù)雜多變，中藥湯劑成分復(fù)雜，且其中某些成分具有抑菌作用，如中藥清熱藥多含有綠原酸、小檗堿等抑菌成分，會影響微生物限度檢查準(zhǔn)確性。因此，本研究采用天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室已經(jīng)過微生物限度驗證的中藥制劑處方，處方均已收錄于2016年版《天津市醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》[3]，按照該院煎藥室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，且煎藥室定期進(jìn)行環(huán)境及設(shè)備微生物監(jiān)測，考察代煎中藥湯劑在不同貯藏時間、溫度下微生物變化情況。

古代由于條件所限，湯劑的煎煮及貯藏與現(xiàn)代不盡相同，如古代無冰箱等控溫冷藏設(shè)備，湯劑多可能當(dāng)天煎煮、當(dāng)天服用，而現(xiàn)代代煎中藥湯劑由于其包裝密封性能良好，多可能將7或14 d湯劑冷藏于冰箱內(nèi)或陰涼通風(fēng)處。因此，本研究選擇貯藏方式及溫度分別為冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存和室溫避光(20±5 ℃)儲存；考察的時間點選擇第0，1，3，7，14，21天，進(jìn)行微生物限度檢測，所監(jiān)測的溫度及時間覆蓋一般代煎中藥湯劑的貯藏期限。

《中華人民共和國藥典》2020年版四部0181合劑項下定義，合劑系指飲片用水或其他溶劑，采用適宜的方法提取制成的口服液體制劑[1]，與湯劑制備符合，因此本研究選擇合劑項下微生物限度檢驗作為標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果顯示，在經(jīng)過微生物檢驗的煎藥環(huán)境下，采用密封包裝的代煎中藥湯劑，無論其在冰箱冷藏室(2～8 ℃)儲存或室溫避光(20±5 ℃)儲存，在14 d內(nèi)其微生物限度均符合《中華人民共和國藥典》2020年版合劑項下微生物限度的要求；但隨儲存時間的延長，其微生物數(shù)量呈逐漸增多趨勢，但每個具體處方微生物數(shù)量趨勢，并無明顯規(guī)律，可能與各處方所含不同飲片和每味飲片在其處方中的比例不同有關(guān)，需在后續(xù)實驗中具體考察單獨處方的微生物限度變化規(guī)律。

綜上所述，由于臨床開具處方豐富多樣，各家中藥湯劑代煎機構(gòu)煎煮設(shè)備、包裝設(shè)備、操作和儲存的環(huán)境不同，代煎中藥湯劑微生物限度有很多影響因素。對影響代煎中藥湯劑質(zhì)量的相關(guān)因素進(jìn)行全面控制，能更好地保證代煎中藥湯劑質(zhì)量穩(wěn)定。本研究由于條件所限，只考察了已有微生物限度檢驗方法的中藥湯劑，且在操作和環(huán)境可控條件下，密封包裝的代煎中藥湯劑的微生物限度，低溫、避光的貯藏條件，更有利于減少代煎中藥湯劑的微生物滋生，保證患者用藥安全。單味飲片煎劑的微生物限度研究、非密封包裝對湯劑微生物限度的影響等，在后續(xù)研究中會逐步納入。開展代煎中藥湯劑微生物限度監(jiān)測的研究，對提高中藥湯劑的質(zhì)量、患者用藥安全和療效具有重要意義。