彭文堅(jiān)，張娟，劉松*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)是一種堿性蛋白酶，能專一性催化蛋白質(zhì)肽鏈中精氨酸(R)或賴氨酸(K)殘基羧基端的肽鍵或酰胺鍵的水解[1]。胰蛋白酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于皮革軟化、洗滌、食品和制藥工業(yè)，約占工業(yè)酶制劑市場(chǎng)的3%[2]。目前大部分市售胰蛋白酶主要從豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物[3]的胰腺組織提取。然而，哺乳動(dòng)物組織提取物通常具有免疫原性及病原體污染[4]等隱患，限制了其在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，微生物來(lái)源胰蛋白酶的開(kāi)發(fā)成為重要研究方向。

目前動(dòng)物來(lái)源胰蛋白酶的異源表達(dá)以豬胰蛋白酶為主要研究對(duì)象，其在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，在包涵體復(fù)性后，最高產(chǎn)量為209 mg/L活性胰蛋白酶[5](2 L發(fā)酵罐)。在畢赤酵母中，豬胰蛋白酶以酶原的形式表達(dá)，產(chǎn)量為480 mg/L，經(jīng)腸激酶激活后酶活力可達(dá)19.2 U/mL[6](5 L發(fā)酵罐)。微生物來(lái)源胰蛋白酶主要研究對(duì)象為尖孢鐮刀菌胰蛋白酶(Fusariumoxysporumtrypsin，F(xiàn)OT)與灰色鏈霉菌胰蛋白酶(Streptomycesgriseustrypsin, SGT)。FOT在畢赤酵母中以成熟酶的形式表達(dá)，酶活力為2.7 U/mL(搖瓶水平)[7]。重組SGT在大腸桿菌中同樣以包涵體形式存在，而在變鉛青鏈霉菌與枯草芽孢桿菌中SGT以成熟酶的形式實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)，最大酶活力分別為9.21 U/mL(搖瓶水平)[8]與33.8 U/mL(搖瓶水平)[9]。針對(duì)SGT表達(dá)量低、酶原活化效率低和穩(wěn)定性差等問(wèn)題，本研究室通過(guò)融合高效分泌信號(hào)肽、自活化前導(dǎo)肽、疏水性前導(dǎo)肽及自降解位點(diǎn)突變(R145I/K101A/R201V)等策略[10-12]，實(shí)現(xiàn)了SGT在畢赤酵母中的高效活性表達(dá)，5 L發(fā)酵罐的酰胺降解酶活力為549.18 U/mL，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的重組SGT最高產(chǎn)量。因此，畢赤酵母較其他宿主更適于SGT的表達(dá)。

目前，研究者已提出一系列基于宿主改造和發(fā)酵條件優(yōu)化提高畢赤酵母產(chǎn)酶性能的策略。畢赤酵母宿主改造主要基于過(guò)量表達(dá)分子伴侶，其中Cne1蛋白具有輔助糖蛋白折疊的功能，與葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)共表達(dá)時(shí)，GOD酶活力提高141%[13]。Ssa4與Bmh2蛋白能夠提高蛋白運(yùn)輸速率，2F5 FAB單克隆抗體片段與其分別共表達(dá)時(shí)，表達(dá)量分別提高了60%與50%[14]。Vhb蛋白能夠增強(qiáng)氧氣運(yùn)輸速率，與纖維素酶Cel5A共表達(dá)時(shí)，Cel5A的酶活提高了40%[15]。此外，轉(zhuǎn)錄因子Yap1參與畢赤酵母碳水化合物代謝與氧化應(yīng)激反應(yīng)，其與β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS共表達(dá)時(shí)，PGUS酶活力提高80.4%[16]。轉(zhuǎn)錄因子Aft1參與蛋白折疊和分泌，與水蛭透明質(zhì)酸酶LHyal共表達(dá)時(shí)，LHyal酶活力提高47.1%[17]。發(fā)酵條件優(yōu)化集中于培養(yǎng)基pH優(yōu)化及補(bǔ)料控制。對(duì)于最適反應(yīng)pH或穩(wěn)定pH偏堿性的重組酶，pH<5.5將限制活性酶的產(chǎn)量。在中性pH條件下誘導(dǎo)表達(dá)Penicilliumcyclopium二酰基甘油脂肪酶在畢赤酵母的胞外表達(dá)量可達(dá)到2.43 g/L[18]。以甲醇為誘導(dǎo)劑的醇氧化酶 (alcohol oxidase，AOX)啟動(dòng)子是畢赤酵母系統(tǒng)最重要的啟動(dòng)子之一，但甲醇對(duì)細(xì)胞的毒害作用日趨受到重視。作為AOX1啟動(dòng)子的非抑制性碳源，山梨醇與甲醇混合補(bǔ)料能將畢赤酵母主要供能途徑由甲醛異化供能轉(zhuǎn)向三羧酸循環(huán)，細(xì)胞產(chǎn)熱與耗氧速率下降的同時(shí)強(qiáng)化目標(biāo)蛋白合成途徑[19-20]。

在前期構(gòu)建的產(chǎn)SGT重組畢赤酵母的基礎(chǔ)上[10-11]，本研究考察了轉(zhuǎn)錄因子(Aft1和Yap1)及分子伴侶(Cne1、Ssa4、Bmh2和Vhb)對(duì)SGT表達(dá)的影響，并優(yōu)化了發(fā)酵pH及補(bǔ)料策略，顯著提高了SGT的發(fā)酵水平，為降低胰蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

整合表達(dá)質(zhì)粒pGAPZB[17]、EscherichiacoliJM109和重組菌PP-SGTm[11](含重組質(zhì)粒pPIC9K-SGTm的PichiapastorisGS115)均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶AvrⅡ、大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、PrimerSTAR Max DNA 聚合酶、酵母基因組DNA 抽提試劑盒，TaKaRa 公司；無(wú)縫克隆試劑盒、博萊霉素、質(zhì)粒提取試劑盒，上海生工公司；酵母粉、胰蛋白胨，Oxoid 公司；底物BAPNA，Sigma 公司(美國(guó))；蛋白質(zhì)Maker、蛋白電泳 Loading buffer、Bis-Tris 預(yù)制凝膠，Invitrogen 公司；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，天根公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 5，蛋白胨 10，NaCl 5，pH 7.0。

YPD 培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，D-葡萄糖 20。

BMMY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，甲醇10 g/L，PBS 50 mmol/L，10×YNB 酵母基礎(chǔ)氮源母液10%(體積分?jǐn)?shù))，生物素 4×10-4g/L。

BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油20 g/L，PBS 50 mmol/L，10×YNB酵母基礎(chǔ)氮源母液10%(體積分?jǐn)?shù))，生物素 4×10-4g/L。

BSMG 培養(yǎng)基(g/L)：CaSO4·2H2O 0.93，K2SO424.6，MgSO4·7H2O 14.9，(NH4)2SO410，甘油 40，六水甘油磷酸鈉 12，PTM1 4 mL/L。

PTM1 微量元素溶液(g/L):CuSO4·5H2O 6，KI 0.08，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02，CoCl20.5，ZnCl220，F(xiàn)eSO4·7H2O 65，Biotin 0.2，H2SO45 mL/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子伴侶及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

按表1引物以畢赤酵母GS115基因組為模板擴(kuò)增Bmh2(Genebank NO:28198501)、Cne1(Genebank NO:8198102)、Ssa4(Genebank NO:8197809)、Yap1(Genebank NO:18200866)與Aft1(Genebank NO:18200866)基因；以質(zhì)粒pGapZB為模板，擴(kuò)增含有相應(yīng)分子伴侶基因同源臂的載體片段。按照上海生工無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)，連接轉(zhuǎn)錄因子或分子伴侶基因與對(duì)應(yīng)載體片段。連接完成后轉(zhuǎn)化E.coliJM109，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。Vhb(GenBank No.AAA27585.1)基因由上海生工根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性合成，并克隆至pGapZB載體(圖1-a)。

將上述分子伴侶及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)載體分別用AvrⅡ酶切，將線性化的載體轉(zhuǎn)化PP-SGTm感受態(tài)。將菌液涂布于含100 μg/mL博萊霉素YPD平板，采用pGapZB載體的通用引物pGAPF與3AOX(表1)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。獲得單一目標(biāo)分子伴侶或轉(zhuǎn)錄因子基因條帶的克隆即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵

重組畢赤酵母于YPD平板30 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落接種含有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，于30 ℃和220 r/min培養(yǎng)至OD600=7。將發(fā)酵液于5 000 r/min離心5 min，去除上清液后，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體沉淀2次。分別用50 mL pH為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0 的BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，于30 ℃和220 r/min 下繼續(xù)發(fā)酵，每24 h補(bǔ)加1%的甲醇。發(fā)酵120 h后，取發(fā)酵上清液測(cè)定SGT酶活力。

為測(cè)定pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，重組畢赤酵母于YPD平板30 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落接種至pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0 的含50 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃和220 r/min培養(yǎng)120 h。測(cè)定OD600并繪制生長(zhǎng)曲線。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 重組畢赤酵母5 L罐發(fā)酵

將重組畢赤酵母在YPD平板上30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種含有200 mL YPD培養(yǎng)基的2 L 搖瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600=7。將發(fā)酵液接種至含有2 L BSMG培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。以50%氨水和30%磷酸溶液控制pH 5.5，設(shè)定初始發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量分別為30 ℃、400 r/min和2 L/min；當(dāng)發(fā)酵液溶解氧上升至60%時(shí)，以0.18/h的比生長(zhǎng)速率，指數(shù)流加250 mL的500 g/L甘油(含12 mL/L PTM1)，通氣量調(diào)節(jié)至4 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧關(guān)聯(lián)(溶解氧維持20%)。指數(shù)速率如公式(1)所示：

(1)

式中：μset，設(shè)定比生長(zhǎng)速率，h-1；ρx0，初始菌體質(zhì)量濃度，g/L；V0，初始體積，L；ρs，發(fā)酵液中甘油濃度，g/L；YX/S，菌體得率系數(shù)，g/g；t，指數(shù)流加開(kāi)始后的發(fā)酵時(shí)間。

待發(fā)酵液溶解氧再次上升至60%時(shí)，控制pH 6.5開(kāi)始恒速流加甲醇與山梨醇[6 g/(L·h)]。甲醇與山梨醇的質(zhì)量比分別設(shè)為20∶0、20∶0.5、20∶1和20∶1.5。每隔12 h取1次樣，測(cè)定菌體干重和酶活力等性質(zhì)。

1.2.4 甘油濃度的測(cè)定

采用高碘酸鈉比色法[21]測(cè)定發(fā)酵液中的甘油濃度。

1.2.5 胰蛋白酶酰胺酶活力的測(cè)定

以Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯酰胺(Nα-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride，BAPNA)為底物測(cè)定胰蛋白酶活力。將100 μL酶液與900 μL BAPNA溶液(50 mmol/L pH 8.0 磷酸鉀緩沖液，20 mmol/L CaCl2，10 mmol/L BAPNA)混合后，測(cè)定其在37 ℃下410 nm處吸光值變化值(ΔA410/min)。酶活力定義為：在37 ℃下，升高0.1即為胰蛋白酶的1個(gè)酰胺酶水解單位[12]。計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.6 畢赤酵母醇氧化酶活力的測(cè)定

取1 mL重組畢赤酵母發(fā)酵液，離心后收集菌體，用去離子水洗滌2次。用50 mmol/L pH 7.5 的PBS重懸并測(cè)定OD600。取300 μL的重懸液于0 ℃高壓勻漿破碎，加入700 μL PBS 溶液，混勻后于4 ℃和8 000 r/min離心10 min，取上清液置于冰上。反應(yīng)體系共3 mL：100 mmol/L pH 6.0 PBS，4.3 μmol/L苯酚，200 μmol/L甲醇，1 μmol/L 4-氨基安替吡啉，15 U的辣根過(guò)氧化物酶以及1 mL待測(cè)酶液。在37 ℃下測(cè)定在500 nm處吸光度的改變，計(jì)算醌的增加量從而測(cè)定醇氧化酶的活力。酶活力單位定義為：1 mL 細(xì)胞重懸液，在OD600=1時(shí)，37 ℃，pH 6.0的條件下1 min產(chǎn)生1 μmol 的過(guò)氧化氫所需的酶量[22]。

1.2.7 SDS-PAGE 凝膠電泳分析

具體操作方法請(qǐng)參考Invitrogen 公司Bis-Tris 預(yù)制凝膠說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子及分子伴侶對(duì)SGT酶活力的影響

在前期構(gòu)建的重組畢赤酵母中[10-11]，以pPIC9K為整合表達(dá)載體，在SGT突變體(R145I/K101A/R201V/Q151P)上游依次融合了高效分泌信號(hào)肽、自活化前導(dǎo)肽及疏水性前導(dǎo)肽(圖1-a)。為進(jìn)一步提高SGT的表達(dá)水平，基于pGAPZB分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子(Aft1和Yap1)及分子伴侶(Cne1、Ssa4、Bmh2和Vhb)的整合表達(dá)載體(圖1-a)，并轉(zhuǎn)化至上述重組畢赤酵母中與SGT共表達(dá)。菌落PCR分析顯示，擴(kuò)增得到的轉(zhuǎn)錄因子及分子伴侶基因片段得到與各自理論分子量一致的條帶(圖1-b)。

M-DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1-Aftl；2-Yapl；3-Cnel；4-Ssa4；5-Bmh2；6-Vhb a-SGT突變體與分子伴侶或轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒示意圖； b-菌落PCR驗(yàn)證共表達(dá)菌株圖1 共表達(dá)SGT突變體與分子伴侶(或轉(zhuǎn)錄因子) 重組畢赤酵母的構(gòu)建Fig.1 The scheme of the recombinant P.pastoris co-expressing SGT mutant and chaperones (or transcription factors)

如圖2所示，甲醇誘導(dǎo)120 h后，共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Aft1使SGT酶活力提高19.71%，達(dá)到217.30 U/mL，而其他轉(zhuǎn)錄因子或分子伴侶的表達(dá)使SGT酶活力有所下降。Aft1的過(guò)表達(dá)也使胞外總蛋白含量較對(duì)照提高了9.8%達(dá)到了753.51 μg/mL。研究表明，在畢赤酵母中Aft1調(diào)控多個(gè)分子伴侶的表達(dá)，涉及蛋白折疊(Pdi1和BiP)、糖基化(Och1)、胞內(nèi)運(yùn)輸(Sec12、Sec23、Sec61和Gos1)及蛋白跨膜運(yùn)輸(Kin1)等過(guò)程[23]。上述結(jié)果表明，Aft1有效促進(jìn)了SGT的分泌表達(dá)。

圖2 共表分子伴侶或轉(zhuǎn)錄因子對(duì)SGT產(chǎn)量的影響Fig.2 The effect of the co-expression of transcription factors or chaperones on SGT yield in shake-flask

2.2 pH對(duì)SGT在畢赤酵母中表達(dá)的影響

在前期研究中，SGT上游融合了牛胰蛋白酶的酶原區(qū)序列DDDDK(圖1-a)，能夠被SGT自身所識(shí)別和切割，使得以前體形式合成的SGT實(shí)現(xiàn)自活化[12]。值得注意的是，SGT的最適反應(yīng)pH為8.0[12]，而畢赤酵母發(fā)酵通常在pH 5.0～5.5的環(huán)境下進(jìn)行，較低pH發(fā)酵環(huán)境顯然不利于SGT的自活化。因此，重組畢赤酵母誘導(dǎo)階段的pH可能是影響SGT活性表達(dá)的重要因素。

搖瓶培養(yǎng)結(jié)果顯示，在BMMY培養(yǎng)基中，重組菌PP-SGTm/Aft1的最適誘導(dǎo)表達(dá)pH為6.5，較pH 5.5下的酶活力提高了16.71%，達(dá)到了253.61 U/mL(圖3-a)。然而，進(jìn)一步將pH提高至7.0，SGT酶活力卻顯著下降(圖3-a)。將重組菌PP-SGTm/Aft1分別接入pH 5～7的BMGY培養(yǎng)基測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，發(fā)酵菌株的最適生長(zhǎng)pH為5.5，發(fā)酵菌株在搖瓶培養(yǎng)64 h后OD600達(dá)到了最大值(圖3-b)。當(dāng)環(huán)境pH達(dá)到7時(shí)，PP-SGTm/Aft1的生長(zhǎng)受到明顯抑制(圖3-b)。上述結(jié)果表明，pH 6.5提高了SGT活化效率的同時(shí)，又確保了重組菌生長(zhǎng)活性。

基于pH優(yōu)化結(jié)果，驗(yàn)證了PP-SGTm/Aft1在5 L罐的發(fā)酵產(chǎn)量。將生長(zhǎng)階段控制在5.5以獲得最大菌體濃度與將誘導(dǎo)階段的pH控制在6.5。為克服發(fā)酵罐常用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(BSM)在pH>5.5易形成磷酸鹽沉淀的問(wèn)題，選用BSMG培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵[18]。如圖4所示，BSMG培養(yǎng)基在發(fā)酵120 h時(shí)，菌體干重達(dá)到最大值121.62 g/L；發(fā)酵144 h后，酶活力達(dá)2 220.34 U/mL，較搖瓶發(fā)酵提高7.75倍。

a-不同pH的BMMY對(duì)SGT產(chǎn)量的影響； b-不同pH的BMGY對(duì)PP-SGTm/Aft1生長(zhǎng)的影響圖3 pH對(duì)重組畢赤酵母PP-SGTm/Aft1發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of pH on the fermentation of the PP-SGTm/Aft1

2.3 雙碳源混合流加提高SGT發(fā)酵水平

重組畢赤酵母單獨(dú)流加甲醇時(shí)，高濃度的甲醇易對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，且細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)途徑會(huì)競(jìng)爭(zhēng)甲醇，影響外源蛋白表達(dá)效率。研究顯示，在誘導(dǎo)過(guò)程中添加少量山梨醇能夠顯著改善上述問(wèn)題[24]。如圖4-a所示，甲醇與山梨醇以20∶0.5的質(zhì)量比混合流加時(shí)，SGT產(chǎn)量在發(fā)酵144 h后達(dá)到了2 667.24 U/mL，較僅流加甲醇的酶活力提高了20.1%。進(jìn)一步提高甲醇與山梨醇質(zhì)量比至20∶1時(shí)，SGT產(chǎn)量有所下降，但仍高于僅流加甲醇的酶活力。當(dāng)甲醇與山梨醇質(zhì)量比達(dá)到20∶1.5時(shí)，SGT產(chǎn)量低于純甲醇流加(圖4-a)。SDS-PAGE分析顯示，在發(fā)酵60 h后各流加條件下，重組菌發(fā)酵上清液均能看到較清晰的SGT蛋白條帶(圖4-b)。與僅流加甲醇相比，甲醇與山梨醇質(zhì)量比為20∶0.5和20∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的SGT蛋白條帶更粗，與酶活力測(cè)定結(jié)果一致(圖4-b)。

與僅流加純甲醇相比，發(fā)酵144 h時(shí)，雙碳源混合流加使菌體量提高22.1%～29.1%，高山梨醇流加比例更有助于菌體生長(zhǎng)(圖4-c)?；旌狭骷幽軌蚋纳凭w生長(zhǎng)狀況，但菌體生長(zhǎng)與SGT的產(chǎn)量并不密切相關(guān)(圖4-a、圖4-c)。重組菌PP-SGTm/Aft1中，SGT以醇氧化酶(AOX)啟動(dòng)子表達(dá)，宿主AOX的變化能夠間接反應(yīng)SGT基因的表達(dá)效率。如圖4-d所示，甲醇與山梨醇以質(zhì)量比20∶0.5和20∶1混合流加時(shí)，發(fā)酵60 h后AOX 活性比單流加甲醇分別提高36.3%和43.7%，且發(fā)酵后期仍能維持更高的AOX活性；而甲醇與山梨醇以質(zhì)量比20∶1.5流加與僅補(bǔ)甲醇的AOX活性相近，且在發(fā)酵后期其活性低于后者(圖4-d)。上述結(jié)果表明，雙碳源混合流加增強(qiáng)了AOX1啟動(dòng)子活性，從而提高SGT在畢赤酵母中的產(chǎn)量。

a-雙碳源混合比例對(duì)SGT活力的影響；b-SDS-PAGE分析雙碳源混合比例對(duì)SGT表達(dá)量的影響； c-雙碳源混合比例對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響；d-雙碳源混合比例對(duì)AOX活力的影響圖4 甲醇與山梨醇混合流加對(duì)PP-SGTm/Aft1發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of the co-feeding of methanol and sorbitol on the fermentation of the PP-SGTm/Aft1

3 結(jié)論與討論

早期應(yīng)用畢赤酵母異源表達(dá)胰蛋白酶的研究中，由于對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究不夠完善使得胰蛋白酶活力達(dá)到19.2 U/mL后沒(méi)有進(jìn)一步提升[6]。隨著畢赤酵母作為表達(dá)異源蛋白宿主的研究不斷深入，使用更高效的表達(dá)元件[10]、發(fā)掘更新穎與高效的轉(zhuǎn)錄因子與分子伴侶[16]以及針對(duì)目的蛋白性質(zhì)優(yōu)化發(fā)酵條件[18]是目前克服畢赤酵母表達(dá)瓶頸的主要手段。

本研究在前期構(gòu)建的高產(chǎn)SGT重組畢赤酵母的基礎(chǔ)上，通過(guò)共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Aft1使搖瓶水平的SGT產(chǎn)量提高19.71%。轉(zhuǎn)錄因子Aft1能夠調(diào)控蛋白分泌相關(guān)的多個(gè)分子伴侶，這可能是較其他分子伴侶更有助于提高SGT表達(dá)水平的主要原因。由于SGT以前體形式合成，發(fā)酵過(guò)程高效自活化亦是影響其活性表達(dá)的重要因素?；赟GT的最適反應(yīng)pH與畢赤酵母最適生長(zhǎng)pH的差異，本研究確定了最佳的發(fā)酵pH為6.5。因此，有效平衡SGT的活化和菌體生長(zhǎng)，同樣是提高SGT活性表達(dá)的有效途徑。在上述菌株改造和條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用混合流加碳源[m(甲醇)∶m(山梨醇)=20∶0.5]使SGT發(fā)酵水平進(jìn)一步提升至2 667.24 U/mL，為其工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

SGT能夠催化蛋白水解，發(fā)酵過(guò)程中成熟SGT的自降解同樣是其高產(chǎn)的主要限制性因素[11]。通過(guò)分子改造提高SGT分子穩(wěn)定性和抗自降解能力，將是其后續(xù)研究的主要內(nèi)容之一。