王帥勇，汪 琪，朱世強，姚 云，虞凌雪，劉曉敏，單同領，鄭 浩，周艷君，童 武，李國新，高 飛，童光志，于 海

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種單股環(huán)狀DNA病毒。之前的研究發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒分為PCV1和PCV2兩個基因型，PCV1是由Tischer等[1]在1974年發(fā)現(xiàn)并被認為是一種細胞污染物，對豬群沒有致病性；PCV2最早是由Clark等[2]在1991年于加拿大被發(fā)現(xiàn)的，對豬群有較強的致病性。很多研究表明PCV2是豬圓環(huán)病毒相關疾?。╬orcine circovirus associated diseases，PCVAD）的主要病原，能夠引起豬的多種疾病，主要包括：斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisytemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）以及仔豬震顫（congenital tremors，CT），給養(yǎng)豬業(yè)造成了非常嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。

2016年，Palinski等[5]首次在美國發(fā)現(xiàn)新的PCV基因型并命名為豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3），該病毒能夠引起多種豬病，與PCVAD非常相似。PCV3的基因組全長為2000 bp，主要包括3個開放性閱讀框（opening reading frame，ORF），其中ORF1主要編碼Rep蛋白，與病毒的復制相關，ORF2主要編碼Cap蛋白，該蛋白是病毒的唯一結構蛋白，與病毒的感染和免疫有較強的相關性。

目前為止，已經(jīng)有多個國家都有關于PCV3的報道，包括中國、巴西、德國、意大利和俄羅斯等[6-10]。通過PCV3在中國不同地區(qū)流行情況的報道可以看出，PCV3已經(jīng)廣泛存在于中國的豬群當中，本實驗室在之前的流行病學調(diào)查過程當中檢測到了PCV3的陽性病料，通過測序獲得了7株PCV3全長基因序列，本研究選取其中1株作為代表株，設計一對針對去核定位信號的ORF2特異性引物，成功擴增PCV3全長基因序列并將其連接到pCold TF載體上，構建了重組的原核表達質粒并對其進行了原核表達，獲得了可溶性的重組蛋白并且對蛋白的抗原性進行了鑒定和分析，為進一步研究PCV3 Cap 蛋白的功能及建立間接ELISA檢測方法奠定了基礎，并為防控PCV3提供了特異、高效的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株 載體pCold TF由本實驗室保存；大腸桿菌E.coliDH5α、表達宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；IPTG購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SaIⅠ、病毒DNA提取試劑盒和質粒提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；pfu高保真DNA聚合酶購自Agilent Technologies公司；引物由金唯智生物公司合成；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自CST公司；DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 引物的設計與合成 應用Primer premier5.0軟件，根據(jù)實驗室之前在檢測病料過程中通過測序獲得的1株PCV3全基因組序列設計1對去掉Cap蛋白N端核定位信號（34個氨基酸）的特異性引物，分析pCold TF載體質粒圖譜，分別在引物的上、下游加入XhoⅠ和SaIⅠ酶切位點和保護性堿基（劃線的堿基）。上游引物：5'-CCGCTCGAGATGAGACACA GAGCTATATA-3'；下游引物：5'-ACGCGTCGAC TTAGAGAACGGACTTGTAA-3'。

1.3 病毒DNA的提取及目的基因的PCR擴增 取實驗室檢測為陽性的病料進行研磨，將研磨液10 000 ×g離心10 min，將離心后的上清液按照DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA全基因組，并以此為模板，通過PCR進行Cap目的基因片段的擴增。PCR反應體系為：ddH2O 37 μL，10×pfu Ultra ⅡRxn Buffer 5 μL，上、下游引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 2 μL，pfu Ultra Ⅱ Fusion Hs DNA 1 μL，總體積為50 μL。將上述PCR反應體系進行震蕩混勻后離心，反應程序為：95℃預變性1 min；95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴增后的核酸產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠進行膠回收。

1.4 重組表達質粒的構建與鑒定 將膠回收產(chǎn)物同pCold TF空載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SaIⅠ雙酶切5 h，膠回收Cap和載體的目的片段，用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑取單個菌落在水平搖床上培養(yǎng)16 h，菌液PCR鑒定后，將陽性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序正確的陽性菌液擴增，提取質粒，獲得的陽性重組表達質粒命名為pCold TF-dPCV3Cap。

1.5 重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析 將重組表達質粒pCold TF-PCV3-dCap轉化到表達宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落在水平搖床上進行增菌培養(yǎng)；當菌液濃度活化至OD600值達0.7左右，按照1∶1000比例加入終濃度為1 mol/mL的IPTG；將菌液轉入水平搖床上分別誘導12、16、20和24 h后收集菌液，10 000 ×g離心10 min取上清液，用適量PBS重懸沉淀并取出適量重懸液與SDSPAGE緩沖上樣液充分混勻，沸水浴10 min。經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，確定IPTG的最佳誘導時間。

1.6 重組蛋白的可溶性分析 收集誘導后的菌液，10 000 ×g離心10 min，用適量PBS重懸后在冰浴中進行超聲波破碎，每次超聲5 s，間隔5 s，破碎至菌液澄清。將破碎后的菌液10 000 ×g離心10 min后，分別收集上清液和沉淀。在沉淀中加入與上清液等體積的PBS重懸，然后取出適量重懸液與SDSPAGE緩沖上樣液充分混勻，沸水浴10 min，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.7 重組蛋白的純化 大量誘導表達重組蛋白，收集菌液，10 000 ×g離心10 min，用適量PBS重懸后在冰浴中進行超聲波破碎并收集上清液，按照磁珠蛋白純化說明書進行純化，用SDS-PAGE來檢測蛋白純度。

1.8 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳，轉印到硝酸纖維素（NC）膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用小鼠陽性血清作為一抗（1∶5000稀釋），在4℃搖床上孵育過夜，用TBST漂洗3次，每次10 min；以辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠lgG為二抗（1∶5000稀釋），常溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，最后應用DAB顯色液進行顯色反應。

2 結果

2.1 目的基因的擴增 用設計的特異性引物擴增Cap蛋白的基因片段，命名為PCV3-dCap，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后獲得與預期大小相符的目的條帶（圖1）。

圖1 PCV3-dCap基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 The PCR products of PCV3-dCap gene

2.2 重組質粒pCold TF-PCV3-dCap的構建及鑒定 將擴增的目的片段與pCold TF載體連接后，通過PCR方法進行菌液鑒定及陽性重組質粒的序列測序。測序結果顯示，PCV3-dCap片段成功連接到pCold TF載體上，并且沒有出現(xiàn)堿基突變和缺失，將獲得的重組質粒命名為pCold TF-PCV3-dCap。

2.3 重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析 通過IPTG誘導表達后收集到大量菌液，取超聲破碎和離心后的上清液及沉淀進行SDS-PAGE鑒定。結果顯示，重組蛋白能夠在上清液中大量表達，大小為75 kDa，與預期一致（圖2）。同時將通過不同誘導時間的上清液進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在誘導時間為20 h時，重組蛋白的表達量最大。

圖2 重組蛋白表達可溶 性分析Fig.2 Soluble analysis of recombinant pCold TF-PCV3-dCap protein by SDS-PAGE

2.4 重組蛋白的純化 在最佳誘導條件下，大量誘導表達重組蛋白，收集菌液后進行超聲破碎和離心，將上清液按照磁珠蛋白純化盒的說明進行純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，目的蛋白純度較高且單一（圖3）。

圖3 重組蛋白的純化Fig.3 The purification of recombinant protein

2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 以陰性小鼠血清作為一抗來進行Western blot實驗。結果顯示，重組蛋白和誘導空載體表達的蛋白在目的條帶位置均沒有出現(xiàn)任何條帶（圖4A）。同時，以陽性小鼠血清作為一抗來進行Western blot實驗，結果顯示重組蛋白在目標條帶位置有明顯的條帶，而誘導空載體所表達的蛋白在目標條帶處沒有條帶（圖4B），表明pCold TF-dPCV3-Cap重組蛋白具有良好的反應原性和特異性。

圖4 重組蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討論

自2016年首次發(fā)現(xiàn)PCV3以來，世界各地均有發(fā)現(xiàn)PCV3的相關報道，由于PCV容易與多種豬源性病原體發(fā)生混合感染[4]，導致豬的多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。PCV感染細胞后不發(fā)生細胞病變，截止目前，世界范圍內(nèi)還沒有成功分離到PCV3野毒株。目前已有多篇報道表明存在PCV2和PCV3共感染的情況[11]，因此建立針對PCV3的特異性檢測方法非常重要。當前針對于PCV的主要防控方式是疫苗接種，因此反應原性和特異性較好的原核表達蛋白對于亞單位疫苗的研發(fā)也具有重要的意義[12]。Cap蛋白是PCV唯一的結構蛋白，主要與病毒的感染復制有關，同時也是檢測PCV的主要指標，目前已經(jīng)有研究表明，PCV2和PCV3的Cap基因同源性很低，兩者之間無法提供交叉保護[13-14]。因此對于PCV3的Cap蛋白的研究具有重要的意義[15]。

本研究通過原核表達方式所獲得的PCV3-dCap蛋白主要在上清液中表達，在表達過程中無需處理包涵體，這為大量表達該蛋白帶來了很大的便利，同時本研究所采用的磁珠純化蛋白的方式較為簡單，可操作性強，在大量純化蛋白時能夠極大的提高純化效率。使用純化后的重組蛋白免疫小鼠，得到的陽性小鼠血清能夠與重組蛋白發(fā)生特異性反應，證明了該蛋白具有良好的免疫原性。本研究原核表達的重組蛋白為建立PCV3抗體特異性檢測方法和亞單位疫苗的研發(fā)奠定了良好的基礎。