程麗，陳梅

(潛江市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，湖北 潛江 433100)

妊娠期高血壓疾病(hypertension disorder complicating pregnancy, HDCP)是孕婦所特有而常見(jiàn)疾病之一，其臨床特點(diǎn)主要包括高血壓、蛋白尿、水腫、昏迷以及心腎功能衰竭，嚴(yán)重時(shí)甚至引發(fā)死亡[1- 3]。HDCP病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胎盤是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的器官，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常會(huì)導(dǎo)致胎盤形成受阻，引發(fā)妊娠相關(guān)疾病[4- 5]。蘿卜硫素(sulforaphane)是一種具有抗氧化損傷作用的活性物質(zhì)，主要成分為異硫氰酸酯[6]，能夠預(yù)防各種類型的癌癥，降低心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并具有抗氧化、抗炎與免疫調(diào)節(jié)等作用[7- 9]。然而蘿卜硫素在妊娠相關(guān)疾病，尤其是HDCP中的作用至今未見(jiàn)報(bào)道。已知N- 硝基- L- 精氨酸甲酯(L- nitro- arginine methyl ester，L- NAME) 作為一氧化氮合酶抑制劑可干預(yù)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，從而能夠模擬HDCP微環(huán)境進(jìn)行相關(guān)體外研究。本研究通過(guò)L- NAME干預(yù)HTR- 8/SVneo細(xì)胞模擬 HDCP微環(huán)境，觀察蘿卜硫素對(duì)HDCP胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響，初步探究其作用的信號(hào)通路，以期為HDCP的研究與診治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR- 8/SV- neo購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，蘿卜硫素(純度≥98%)購(gòu)自杭州林格貝公司(批號(hào)20171106- 2)，c- Jun氨基末端激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)信號(hào)通路阻斷劑SB203580和L- NAME購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清、青霉素、鏈霉素及DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8(CCK- 8)和Annexin V- FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技公司，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京默沙克公司，腫瘤壞死因子- α(TNF- α)、白細(xì)胞介素(IL)- 1β、IL- 6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物有限公司，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，磷酸化JNK(p- JNK)抗體、JNK抗體、磷酸化p38 MAPK(p- p38 MAPK)抗體、p38 MAPK抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HTR- 8/SV- neo細(xì)胞株復(fù)蘇后，添加含10%胎牛血清、青霉素(100 U·ml-1)/鏈霉素(100 μg·ml-1)雙抗液的DMEM/F12 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每 2 d換液 1 次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，本實(shí)驗(yàn)使用第3～5代細(xì)胞。

1.3 分組與藥物處理

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞調(diào)整濃度為4×104個(gè)·ml-1，取100 μl接種到96 孔板。實(shí)驗(yàn)分組包括對(duì)照組、模型組、3個(gè)劑量(10、20、40 μmol·L-1)蘿卜硫素組和阻斷劑組。細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不同劑量蘿卜硫素組細(xì)胞分別使用終濃度為10、20、40 μmol·L-1的蘿卜硫素培養(yǎng)72 h，阻斷劑組細(xì)胞使用終濃度為15 μmol·L-1的SB203580培養(yǎng)24 h，接著，除對(duì)照組外的其余各組細(xì)胞均繼續(xù)使用100 μmol·L-1的L- NAME干預(yù)48 h，收集細(xì)胞。

1.4 CCK- 8實(shí)驗(yàn)

將HTR- 8/SV- neo細(xì)胞按照1.3所述分組與處理后，每孔加入10 μl CCK- 8試劑，混合均勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中反應(yīng) 1 h，上酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 Annexin V- FITC/PI雙染法

將HTR- 8/SV- neo細(xì)胞按照1.3所述分組與處理后，使用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，以PBS洗滌2次，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次加入5 μl 的Annexin V- FITC和PI試劑，混勻后在室溫下避光反應(yīng)15 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 MDA、SOD 和 GSH水平檢測(cè)

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞，裂解細(xì)胞獲取上清液，采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)MDA含量，化學(xué)比色法檢測(cè)SOD、GSH活性，具體按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 ELISA法

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞，裂解細(xì)胞并提取上清液，使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中TNF- α、IL- 1β、IL- 6含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.8 TUNEL染色

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞，PBS洗滌后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，含0.3% Triton X- 100的PBS重懸細(xì)胞，室溫孵育5 min，加入TUNEL檢測(cè)液，充分混勻，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌細(xì)胞后進(jìn)行涂片，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液置于冰上進(jìn)行裂解，以10 000×g 離心20 min后取上清，BCA法對(duì)蛋白含量定量。每孔加入20 μg總蛋白樣品進(jìn)行10%SDS- PAGE 凝膠電泳，將分離蛋白電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入稀釋的抗體p- JNK(1∶1 000)、JNK抗體(1∶1 000)、p- p38MAPK抗體(1∶1 000)、p38MAPK抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，次日，TBST液洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫孵育 2 h 后滴加ECL超敏發(fā)光液顯色，凝膠成像儀中曝光成像，BandScan 5.0軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算各條帶的相對(duì)灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞存活率比較

HTR- 8/SV- neo細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示，6組間細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素作用的細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，而經(jīng)15 μmol·L-1SB203580作用的細(xì)胞存活率也顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞存活率比較

2.2 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，經(jīng)10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細(xì)胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

a 與對(duì)照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

TUNEL染色結(jié)果顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組細(xì)胞凋亡數(shù)較少，模型組細(xì)胞TUNEL染色增加，細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，經(jīng)10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細(xì)胞TUNEL染色減少，細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

a 與對(duì)照組比較，P<0.05； b與模型組比較，P<0.05

2.3 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞MDA含量及SOD、GSH活性比較

HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中MDA含量及SOD、GSH活性檢測(cè)結(jié)果顯示，各組間細(xì)胞中同一指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中MDA含量顯著增加，SOD、GSH活性顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細(xì)胞中MDA含量顯著減少，而SOD、GSH活性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中MDA含量和SOD、GSH活性

2.4 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組細(xì)胞中TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，經(jīng)10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細(xì)胞，TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞TNF- α、IL- 1β和IL- 6水平

2.5 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞JNK/p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中 p- JNK與p- p38MAPK蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素組作用的細(xì)胞中p- JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，20、40 μmol·L-1蘿卜硫素組作用的細(xì)胞中p- p38MAPK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，15 μmol·L-1SB203580作用細(xì)胞后也顯著抑制了p- JNK與p- p38MAPK蛋白表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖3與表4。

表4 各組HTR- 8/SV- neo細(xì)胞p- JNK、JNK、p- p38MAPK及p38MAPK蛋白表達(dá)水平

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p- JNK、JNK、p- p38MAPK及p38MAPK蛋白表達(dá) A.對(duì)照組； B.模型組； C.10 μmol·L-1蘿卜硫素組； D.20 μmol·L-1蘿卜硫素組； E.40 μmol·L-1蘿卜硫素組； F.阻斷劑組

3 討 論

HDCP占妊娠者的大約10%，是目前婦產(chǎn)科處理最棘手的問(wèn)題。在過(guò)去的幾十年，HDCP的發(fā)病率呈增加趨勢(shì)，主要?dú)w因于產(chǎn)婦肥胖、高齡和合并癥等因素。HDCP使得產(chǎn)婦患腦血管疾病、胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)以及產(chǎn)婦、圍產(chǎn)兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。HDCP的發(fā)病機(jī)制源于胎盤異常，其中心環(huán)節(jié)是滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常所致的胎盤功能障礙[3]。然而胎盤的正常生長(zhǎng)和發(fā)育是成功植入和妊娠的關(guān)鍵，并且需要調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力及其在蛻膜中的分化和增殖[10]。此外，在妊娠期間胎盤功能障礙、先兆子癇和宮內(nèi)生長(zhǎng)受限是導(dǎo)致許多圍生兒死亡的主要原因。因此，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能在HDCP發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)L- NAME干預(yù)誘導(dǎo)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞凋亡增加，說(shuō)明L- NAME干預(yù)導(dǎo)致了HTR- 8/SV- neo細(xì)胞異常生物學(xué)行為的發(fā)生。

蘿卜硫素能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)酶來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷，改變與細(xì)胞周期、凋亡及血管生成有關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性，這在癌癥的治療中起著至關(guān)重要的作用[11]。此外，還有研究表明蘿卜硫素能夠影響核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)的活化以及對(duì)核因子- κB(NF- κB)信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮間接抑制作用，從而抑制組織中的炎癥反應(yīng)[12]。在本研究中，先經(jīng)10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素處理的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞再經(jīng)L- NAME干預(yù)，提高了細(xì)胞存活率，并有效抑制了細(xì)胞的凋亡，由此推測(cè)，蘿卜硫素能夠改善HDCP中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的異常凋亡現(xiàn)象。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，高血壓是由補(bǔ)體、炎性體的激活以及循環(huán)免疫細(xì)胞中髓樣細(xì)胞表型改變所引起[13]，因此炎癥反應(yīng)也是高血壓的發(fā)病機(jī)制之一。各炎癥過(guò)程之間相互依賴，最終通過(guò)涉及氧化應(yīng)激、內(nèi)源蛋白質(zhì)修飾以及抗原加工和呈遞機(jī)制的改變參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)。同樣，在HDCP患者血清中檢測(cè)到多種炎癥因子出現(xiàn)不同程度的變化，并且能夠反映HDCP病情嚴(yán)重程度[14]。本研究結(jié)果顯示，L- NAME干預(yù)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量增加，該結(jié)果也表明在L- NAME誘導(dǎo)模擬的HDCP微環(huán)境中出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，而經(jīng)10、20、40 μmol·L- 1蘿卜硫素作用的細(xì)胞，TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量均明顯減少，由此表明蘿卜硫素可能會(huì)抑制HDCP中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是由活性氧與抗氧化能力之間的不平衡所導(dǎo)致的，是妊娠病理生理過(guò)程中的重要因素。當(dāng)胎盤中的氧化應(yīng)激超過(guò)抗氧化劑防御機(jī)制的能力時(shí)，氧化損傷會(huì)擴(kuò)散到其他組織。由氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮功能障礙與妊娠并發(fā)癥，包括先兆子癇、早產(chǎn)和反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[15- 17]。SOD和GSH具有抗氧化物酶性質(zhì)，能夠通過(guò)協(xié)同清除ROS和自由基來(lái)減輕氧化性損傷；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，含量的高低可體現(xiàn)氧化反應(yīng)的狀態(tài)[18]。本研究結(jié)果顯示，L- NAME干預(yù)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中SOD、GSH活性降低，而MDA含量增加，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素作用后再經(jīng)NAME干預(yù)，細(xì)胞中SOD、GSH活性明顯升高，MDA含量則減少，這表明蘿卜硫素可能會(huì)對(duì)HDCP內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)起到有效的抑制作用。

JNK/p38MAPK信號(hào)通路激活后，可通過(guò)與底物結(jié)合參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等過(guò)程[19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)L- NAME干預(yù)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中p- JNK與p- p38MAPK 蛋白表達(dá)水平均升高，而預(yù)先使用20、40 μmol·L-1蘿卜硫素處理能夠抑制p- JNK和p- p38MAPK的蛋白表達(dá)水平。此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在L- NAME干預(yù)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中預(yù)先加入JNK/p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB203580處理，結(jié)果與蘿卜硫素處理細(xì)胞再經(jīng)L- NAME干預(yù)的效果一致，即阻斷JNK/p38MAPK信號(hào)通路能夠抑制L- NAME誘導(dǎo)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果提示，蘿卜硫素可能通過(guò)抑制JNK/p38MAPK信號(hào)通路的激活從而發(fā)揮對(duì)HDCP中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上，蘿卜硫素可能通過(guò)抑制JNK/p38MAPK信號(hào)通路的激活來(lái)降低L- NAME誘導(dǎo)的HTR- 8/SV- neo細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平，并抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)在體外利用L- NAME誘導(dǎo)HTR- 8/SV- neo細(xì)胞模擬HDCP微環(huán)境，闡明了蘿卜硫素的作用及其機(jī)制，這為臨床治療HDCP的藥物研發(fā)與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。