鄭平 王玲 童芬美*

內(nèi)毒素血癥或膿毒血癥患者可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致多器官功能衰竭和早期心肌功能障礙［1-2］。約45%的膿毒血癥患者心肌損傷持續(xù)發(fā)展，心功能障礙預(yù)后不良［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中也觀察到心功能障礙［5-6］。LPS 位于革蘭陰性菌細(xì)胞壁最外層，可明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，影響心臟功能［7］，且其心臟并發(fā)癥與心臟細(xì)胞凋亡和促炎細(xì)胞因子過表達(dá)有關(guān)［8］。此外，研究也報(bào)道了LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子激活與核因子κB（NF-κB）刺激多種促炎細(xì)胞因子過表達(dá)有關(guān)，從而影響心肌功能［9］。相反，NF-κB 失活被證明可以減輕LPS 誘導(dǎo)的心功能障礙［10-11］。金蓮花具有清熱解毒、抗菌消炎等功效。其黃酮類化合物為金蓮花的主要活性成分，具有保護(hù)心腦血管及心肌缺血再灌注損傷的作用［12］。本研究在建立LPS 誘導(dǎo)大鼠心肌損傷的基礎(chǔ)上，探討金蓮花總黃酮對(duì)大鼠心臟炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD 大鼠24 只，體重（200±20）g，購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組（control組），脂多糖組（LPS組），金蓮花總黃酮組（FTTF組）和金蓮花總黃酮+脂多糖組（FTTF+LPS組）。FTTF組和FTTF+LPS組大鼠灌胃給予金蓮花總黃酮，100 mg/kg［12］，1 周，control組和LPS組給與等量純水。第7 天灌胃后2 h LPS組和FTTF+LPS組大鼠腹腔注射脂多糖（10 mg/kg），control和FTTF組給予同等體積生理鹽水。

1.2 主要試劑與儀器 金蓮花總黃酮由西安瑞盈生物科技有限公司提?。ㄅ?hào)：20160414，純度：98%）購(gòu)自于西安瑞盈生物科技有限公司（20160414）。ELISA試劑盒購(gòu)自于武漢華美生物工程有限公司（IL-6：CSB-E04640R，IL-1β：CSB-E11987r，TNF-α：CSBE11987r）；CD68 抗體購(gòu)自于武漢塞維爾生物有限公司（貨號(hào)：GB11067），NF-κB 及磷酸化NF-κB 抗體（貨號(hào)：mAb #8242，mAb #3033），STAT3 以及磷酸化STAT3抗體（貨號(hào)：mAb #9139，mAb #9145）抗體均購(gòu)自于CST 公司。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)湘儀離心機(jī)儀器有限公司，TGL-16M），電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 HE 染色觀察心臟病理學(xué)改變 造模結(jié)束后，各組大鼠用25%烏拉坦5 mL/kg 腹腔注射麻醉，分離大鼠心臟左心室置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.4 免疫組化檢測(cè)心肌CD68 表達(dá)水平 心肌組織于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。按照流程脫蠟至水，抗原修復(fù)，加入一抗過夜，加入二抗（37℃，1 h），DAB 染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織表達(dá)水平。

1.5 ELISA 檢測(cè)炎癥因子表達(dá) 心肌組織勻漿液于4℃ 3000 r/min 離心10 min 取上清液，采用ELISA 方法測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.6 Western blot 檢測(cè)NF-κB 和STAT3 及其磷酸化水平 心臟組織按100 mg/ml 加入蛋白裂解液，超聲破碎后，離心（12,000 r/min，15 min，4℃）取上清，測(cè)定蛋白濃度后，變性，-80℃保存待用。制備分離膠和濃縮膠，每孔蛋白上樣量為50 μg 蛋白，電泳（80 V，40 min；160 V，90 min）。電泳結(jié)束后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)（300 mA，90 min），5%脫脂牛奶封閉，加入一抗（1 ∶1000）4 ℃孵育過夜；TBST 清洗3 次，加入相應(yīng)二抗（1 ∶5000）孵育2 h 后，ECL 發(fā)光顯色。采用Image J 軟件分析灰度值，以p-NF-κB/NF-κB 以及p-STAT3/STAT3 比值表示磷酸化水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組比較行單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較方差齊者采用Turkey 檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett'st檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花總黃酮對(duì)LPS 大鼠心肌炎癥反應(yīng)的影響 與Control組比較，LPS組大鼠心肌組織排列紊亂，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。給予金蓮花總黃酮干預(yù)能明顯改善心肌細(xì)胞的病理改變，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織病理學(xué)形態(tài)（HE ×400）

2.2 金蓮花總黃酮對(duì)LPS 大鼠心肌CD68 表達(dá)的影響 與Control組比較，LPS組大鼠心肌組織CD68 表達(dá)明顯增多（P<0.001），給予金蓮花總黃酮干預(yù)能降低心肌組織CD68 表達(dá)水平（P<0.05）。見圖2。

圖2 CD68在各組大鼠心肌組織的表達(dá)（×400）

2.3 金蓮花總黃酮對(duì)LPS 大鼠心肌炎癥因子水平的影響 與Control組比較，LPS組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯增多（P<0.001），金蓮花總黃酮干預(yù)能明顯降低心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（）

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（）

注：與Control組比較，*P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 金蓮花總黃酮對(duì)LPS 大鼠心肌NF-κB 和STAT3及其磷酸化水平的影響 與Control組比較，LPS組大鼠心肌組織中p-NF-κB/NF-κB 及p-STAT3/STAT3比值均明顯上調(diào)（P<0.001，P<0.01），金蓮花總黃酮干預(yù)能明顯降低心肌組織NF-κB 及STAT3 磷酸化水平（P<0.01，P<0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠NF-κB，STAT3表達(dá)及其磷酸化水平比較

3 討論

金蓮花是一種用于治療炎癥相關(guān)疾病的中藥，如腸道感染、扁桃體炎、咽炎等［13］。金蓮花口服液在抗炎和清熱解毒方面起到較好的效果［14］。金蓮花的主要化學(xué)成分中總黃酮約占金蓮花干重的16%，被認(rèn)為是金蓮花中最主要活性物質(zhì)，藥理學(xué)研究也證實(shí)金蓮花抗菌抗炎的主要活性成分是黃酮類化合物［15］。本研究發(fā)現(xiàn)金蓮花總黃酮可明顯改善PLS 誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌受損。

大量證據(jù)表明IL-6 和TNF-α 等促炎因子的上調(diào)是心室重構(gòu)的直接因素，IL-6-STAT3 信號(hào)通路的激活，致使進(jìn)一步心室重構(gòu)的發(fā)展。IL-1 是多種細(xì)胞感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答因子，無(wú)論在體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［16］，TNF-α 和IL-1 均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，繼而放大炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果提示，金蓮花總黃酮干預(yù)能夠降低IL-6、IL-1 及TNF-α 表達(dá)，減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠心肌炎癥反應(yīng)。

NF-κB 在炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵性作用，是IL-6、IL-1β以及TNF-α等炎癥因子主要的調(diào)節(jié)劑。NF-κB信號(hào)通路是心肌肥厚發(fā)生的主要途徑之一［16］，研究證明NF-κB 信號(hào)通路的激活能介導(dǎo)IH 誘導(dǎo)的心室重構(gòu)［17］。NF-κB 磷酸化激活后入核，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）的磷酸化在促進(jìn)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期中起重要作用［18］。研究表明，IL-6 主要通過激活JAK/ STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖［19］。本研究結(jié)果顯示，金蓮花總黃酮的干預(yù)下調(diào)LPS 誘導(dǎo)大鼠心肌NF-κB 和STAT3 的磷酸化水平。

綜上所述，金蓮花總黃酮可以通過下調(diào)LPS 誘導(dǎo)大鼠心肌NF-κB 和STAT3 磷酸化水平，降低IL-6、IL-1β 以及TNF-α 等炎癥因子水平，從而改善大鼠心肌炎癥損傷，為內(nèi)毒素血癥的中醫(yī)藥防治提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。