王雪如，閆 鋒，張海燕，馬金燕，張延輝

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室/新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】狗牙根(CynodondactylonL.)是一種典型的具有休眠特征的多年生草本，在草坪綠地中應(yīng)用廣泛，屬于C4途徑的植物，抗旱性很強(qiáng)，但當(dāng)秋季降臨，其上部莖葉即慢慢枯黃，進(jìn)入休眠，是狗牙根生存的策略之一[1-2]，狗牙根是一種暖季型草坪草，在入秋后緩慢進(jìn)入枯黃，即進(jìn)入休眠狀態(tài)，由地下根莖及芽維持生命，芽內(nèi)的生理物質(zhì)在響應(yīng)休眠的過程中發(fā)揮重要作用，研究狗牙根休眠過程中生理物質(zhì)的變化規(guī)律，了解狗牙根資源的生長習(xí)性，對于如何更好的在草坪綠地建設(shè)中發(fā)揮作用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】多年生草本植物，營養(yǎng)繁殖是其繁衍的主要方式之一，地下部分尤其是根部的休眠芽對于植株的再生有非常重要的作用。羊草地下芽庫中各類型芽及所形成子株和母株的季節(jié)動態(tài)變化研究結(jié)果表明，當(dāng)年返青母株是由上1年母株形成的80%的分蘗芽與分蘗芽子株，15%的根莖頂芽與根莖頂芽子株，以及5%根莖節(jié)芽和根莖節(jié)芽子株組成的，分蘗芽與分蘗芽子株是返青母株的主體[3]。分蘗特性是草坪綠地質(zhì)量的關(guān)鍵。休眠是次年分蘗誘發(fā)的主要影響因素，分蘗芽通常都經(jīng)歷過休眠過程。植物進(jìn)入休眠期后，各項生理物質(zhì)都會發(fā)生變化。蓋樹鵬等[4]研究牡丹芽休眠的生理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)活性氧、自由基在低溫處理初期迅速上升、保護(hù)酶系初期保持較低的活性，有利于保持較高膜脂過氧化水平，增加膜脂透性，促進(jìn)休眠解除；休眠基本解除時，活性氧迅速下降。膜脂過氧化可能作為休眠解除的信號物質(zhì)在早期起作用。劉國琴等[5]研究中華壽桃花芽在2013～2015年2年度間休眠進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)花芽內(nèi)休眠及其解除過程中花芽可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸降低，而總氨基酸含量則逐漸升高，POD活性和H2O2含量呈相似的變化趨勢；抗壞血酸(AsA)含量呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化規(guī)律。Somayeh Esmaili等[6]研究發(fā)現(xiàn)，狗牙根降低溫度和光照時間會增加脯氨酸含量；在芽和根中，還原糖隨溫度降低而增加，而隨光持續(xù)時間降低而下降。Matthew J. Fagerness等[7]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度較低時，導(dǎo)致狗牙根草坪密度和質(zhì)量下降，低溫降低了狗牙根的競爭力，而低溫是誘發(fā)狗牙根休眠的主要原因。【本研究切入點】針對植物休眠的研究，大多數(shù)都集中在木本植物芽的休眠或者種子的休眠，在草本植物中對根莖上芽的休眠研究很少，對于狗牙根芽休眠的機(jī)理研究幾乎未見報道。作為一種復(fù)雜的生命活動過程，芽休眠受多個因素的綜合調(diào)控[8]，研究滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、膜質(zhì)氧化、幾種關(guān)鍵酶的變化等解析狗牙根芽休眠的生理變化動態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集8種不同地區(qū)狗牙根的地下芽，對狗牙根芽體進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)、膜質(zhì)氧化、酶活性等生理指標(biāo)的測定。研究狗牙根地下芽休眠的生理響應(yīng)規(guī)律，分析狗牙根休眠時生理物質(zhì)響應(yīng)規(guī)律，為研究狗牙根休眠機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗區(qū)位于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪實習(xí)基地內(nèi)，該區(qū)域87°40′24″E、43°46′12″N，海拔約739 m。晝夜溫差大，寒暑變化劇烈，降水偏少，四季分配不均，冬季長，夏季短，春秋不明顯，常出現(xiàn)大風(fēng)和驟然降溫天氣。全年平均氣溫7.2℃，1月平均氣溫-17℃，7月平均氣24.6℃，極端最高氣溫42℃，極端最低氣溫-38℃。年均降水量228.8 mm，年均蒸發(fā)量2 647 mm。試驗地土壤類型為沙性壤土，無鹽堿危害，土壤土層較厚，土壤理化性狀和土壤質(zhì)地良好。

在2019年度采集新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪草資源圃內(nèi)的8種狗牙根材料(品種)，將其營養(yǎng)體(根莖)種植于花盆內(nèi)，在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室栽培養(yǎng)護(hù)。表1

表1 8種狗牙根材料采集地點Table 1 Collection sites of eight Cynodon dactylon (L.) Pers.

1.2 方 法

狗牙根夏季生長旺盛，在9月下旬緩慢進(jìn)入休眠狀態(tài)，地上部分葉片逐漸變黃。在2019年8月6日(未休眠)、9月16日(休眠起始)和10月16日(休眠中)3個不同時間段，分別采集8份狗牙根種質(zhì)材料的地下芽，每份種質(zhì)材料取30個。采集的芽用錫箔紙包好迅速放入液氮罐中，帶回實驗室后取出放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采集的狗牙根芽體進(jìn)行常規(guī)生理指標(biāo)的測定，游離脯氨酸含量采用茚三酮法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法，SOD、POD活力、MDA含量，均參照李合生的方法[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

芽體使用軟件LASV4.6采集圖像并作對比。試驗結(jié)果采用Excel 2010、SigmaPlot 12.5和SPSS 21等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離脯氨酸含量

研究表明，在休眠前期-休眠起始-休眠進(jìn)入3個階段(8月、9月、10月)，狗牙根地下芽體內(nèi)的脯氨酸含量隨著溫度下降，總體呈上升趨勢，變化范圍為296.157～839.1 364 μg/gFW。在未休眠階段(8月)，脯氨酸整體含量與9、10月相比都比較低，其中，C45含量最低(35.069 6 μg/gFW)，C130含量最高為499.447 μg/gFW，其次是C48為430.061 μg/gFW。在休眠起始階段(9月)，除個別材料外(新農(nóng)1號、托克遜)，其余狗牙根芽中脯氨酸含量均有增加，C130含量最高為1 058.79 μg/gFW。在休眠中的階段(10月)，狗牙根芽中脯氨酸含量達(dá)到最大值，其中，C45脯氨酸含量值為752.515 μg/gFW，C130達(dá)到最大值為1 072.84 μg/gFW。圖1

圖1 不同休眠時期狗牙根芽內(nèi)脯氨酸含量比較Fig.1 Comparison of proline content in budof Cynodon dactylon (L.) Pers.during different dormancy period

2.2 可溶性蛋白含量

研究表明，8月可溶性蛋白含量很低，C66含量最低為0.000 1 mg/g，C48含量最高為0.002 mg/g，與9、10月相比，差異顯著(P<0.05)。9月可溶性蛋白含量增加，C66含量為0.567 mg/g，C48含量增加到1.595 mg/g，C133可溶性含量為2.021 mg/g，表明在休眠起始，可溶性蛋白開始顯著增加。進(jìn)入休眠中(10月)，可溶性蛋白繼續(xù)增加，C66和C130含量較高，分別為4.338和4.367 mg/g，C48含量也有增加，值為1.787 mg/g，但增加幅度顯著低于其他地區(qū)狗牙根。C133持續(xù)增加到3.644 2 mg/g。圖2

圖2 不同時間段可溶性蛋白含量比較Fig.2 Comparison of soluble protein content in different time interval

2.3 保護(hù)酶系統(tǒng)

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性

研究表明，狗牙根芽體內(nèi)SOD活性隨時間變化先升高后降低。8月新農(nóng)3號芽內(nèi)的SOD活性最低為86.469 μ/gfW，顯著低于其他地區(qū)狗牙根(P<0.05)，C133芽內(nèi)酶活性高于其他地區(qū)狗牙根芽，活性值為174.781 μ/gfW。9月狗牙根芽內(nèi)的活性均升高，新農(nóng)3號芽內(nèi)酶活性增加至170.883 μ/gfW，C133增加到204.515 8 μ/gfW，其中C66SOD活性最低為168.375 μ/gfW，C45SOD活性最高為237.48 μ/gfW，顯著高于其他地區(qū)狗牙根(P<0.05)。到10月狗牙根芽內(nèi)的活性明顯下降，C133SOD活性最低為31.177 μ/gfW，略低于其他品種，新農(nóng)3號芽內(nèi)酶活性降低到32.020 4 μ/gfW，C48SOD活性均高于其他品種為89.232 μ/gfW。狗牙根芽體SOD活性有所上升，SOD活性減少，狗牙根已進(jìn)入休眠期，直到細(xì)胞膜失去活性，莖葉死亡。圖3

2.3.2 過氧化物酶(POD)活性

比較狗牙根芽內(nèi)3個不同生長時期內(nèi)POD活性值，其變化趨勢與SOD相似，先升高后降低，但降低后的活性值大體上高于8月的活性。8月C39的POD活性顯著低于其他地區(qū)狗牙根為908.854 U-1min-1(P<0.05)，C45的POD活性最強(qiáng)為2 407.75 U-1min-1。9月POD活性值升高，其中C48的POD活性較低為1 243.56 U-1min-1，C39芽內(nèi)酶活性增加到2 355.5 U-1min-1，C45芽內(nèi)POD活性增加到2 545.71 U-1min-1，新農(nóng)1號的POD活性顯著高于其他地區(qū)狗牙根值為3 608.58 U-1min-1。到10月呈下降趨勢，新農(nóng)1號POD活性值降為1 321.5 U-1min-1，C45降到1 608.469 5 U-1min-1，C39降低到1 854.99 U-1min-1。圖4

圖3 不同時間段SOD活性比較Fig.3 Comparison of SOD activities in different time interval

2.4 丙二醛(MDA)含量

研究表明，在8、9月，新農(nóng)1號MDA含量最低為0.004 μmol/g，C133的MDA含量值顯著高于其他狗牙根為0.010 μmol/g(P<0.05)，其次是C66，其活性值為0.008 μmol/g。9月這些地區(qū)狗牙根(C45、C48、C66、新農(nóng)1號、新農(nóng)3號)芽內(nèi)MDA含量上升，膜質(zhì)抗氧化能力偏弱。在未進(jìn)入休眠之前，各種狗牙根芽體內(nèi)的MDA含量基本保持穩(wěn)定，屬于較高的水平，不同材料在2個月之間呈現(xiàn)出差異，但差異不顯著(P<0.05)。

10月后，狗牙根芽內(nèi)的MDA含量值均降低，顯著低于8和9月的含量值，新農(nóng)1號芽內(nèi)MDA含量降低至0.001 μmol/g，C133芽內(nèi)MDA含量降到0.003 μmol/g。其中C48最低為0.001 μmol/g。圖5

圖4 不同時間段POD活性比較Fig. 4 Comparison of POD activities in different time interval

圖5 不同時間段MDA含量的比較Fig. 5 Comparison of MDA content in different time interval

3 討 論

目前，已有大量的研究發(fā)現(xiàn)，植物芽休眠進(jìn)程與脯氨酸、抗氧化酶、可溶性蛋白等生理物質(zhì)的變化密切相關(guān)[10-13]。但這些生理物質(zhì)的變化規(guī)律卻不盡一致，不同物質(zhì)響應(yīng)的規(guī)律有差異。

植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，把脯氨酸含量變化作為抗脅迫的重要生理指標(biāo)。在植物休眠的進(jìn)程中，發(fā)現(xiàn)低溫往往是與休眠相伴，在狗牙根中低溫是誘導(dǎo)休眠的關(guān)鍵因素。在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加[14,15]。鄭小林等[16]研究結(jié)果認(rèn)為，假儉草經(jīng)過低溫處理后，葉片的游離脯氨酸隨溫度的降低而大量累積。王洪春[17]研究認(rèn)為，草坪草在低溫下游離脯氨酸的大量積累是對低溫脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。黃錦文等[18]發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，溝葉結(jié)縷草和結(jié)縷草體內(nèi)脯氨酸含量都極顯著遞增；陳登文等[10]發(fā)現(xiàn)，在杏枝芽休眠期間，脯氨酸隨著低溫需求量的增加，會出現(xiàn)增加趨勢，脯氨酸含量與低溫需求量存在著相關(guān)關(guān)系。試驗與該研究相一致，10月緩慢進(jìn)入低溫階段，狗牙根芽中脯氨酸含量達(dá)到最大值，由于低溫影響，狗牙根準(zhǔn)備進(jìn)入休眠階段，脯氨酸的積累可以幫助機(jī)體度過低溫逆境。

植物進(jìn)入休眠后，芽體內(nèi)水分含量及存在狀態(tài)、膜透性、可溶性蛋白、碳水化合物、脯氨酸等含量均發(fā)生顯著變化。于芹[13]研究油桃芽體隨自然休眠誘導(dǎo)進(jìn)程的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)9月底10月初，休眠誘導(dǎo)后期芽體總含水量逐漸下降并穩(wěn)定在較低的水平，芽體開始進(jìn)入自然休眠期。芽體MDA含量均呈下降趨勢，花芽中降幅較大。芽體可溶性蛋白和脯氨酸含量隨著休眠誘導(dǎo)進(jìn)程的發(fā)展呈上升趨勢。研究結(jié)果也顯示，隨著溫度降低，狗牙根進(jìn)入休眠，芽體內(nèi)的可溶性蛋白也隨之升高，低溫環(huán)境對狗牙根造成一定的傷害，因此，體內(nèi)可溶性蛋白大量積累以減少低溫對機(jī)體的傷害，持續(xù)降溫，狗牙根會進(jìn)入休眠狀態(tài)以度過低溫階段。

多項研究表明，POD、SOD等是植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)，它們之間相互協(xié)調(diào)，共同協(xié)作，清除膜脂過氧化過程中產(chǎn)生的活性氧[19,20]。多項研究表明，SOD、POD活性與休眠進(jìn)程相關(guān)，敏感響應(yīng)期約在進(jìn)入休眠誘導(dǎo)期的前1周[12]。暖季型草坪草在受到低溫脅迫時，體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)會提高酶活性，幫助機(jī)體度過逆境，長期的低溫影響會使狗牙根進(jìn)入休眠狀態(tài)，其酶活性也會隨之降低。研究中也發(fā)現(xiàn)，SOD在狗牙根進(jìn)入休眠后保持較低水平，與未休眠前相比較，明顯降低，而且該指標(biāo)在不同狗牙根材料中的表現(xiàn)比較一致。而對于POD酶，休眠前后也有波動，在休眠中比較穩(wěn)定。

MDA含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)，一般植物在逆境條件下就會產(chǎn)生膜質(zhì)過氧化。畢磊研究梨花芽休眠特性及解除休眠，表明MDA含量自然休眠期間下降。范克欣[11]研究表明，油桃休眠期間花芽內(nèi)MDA含量在休眠初期持續(xù)上升，在深休眠期降低并一直保持較低水平。進(jìn)入休眠后，膜質(zhì)過氧化程度加重，MDA含量降低。研究中，狗牙根芽在休眠階段MDA含量顯著降低，該指標(biāo)對于發(fā)現(xiàn)狗牙根進(jìn)入休眠的進(jìn)程具有指示作用，可以作為狗牙根芽進(jìn)入休眠的判定指標(biāo)。

4 結(jié) 論

狗牙根芽體內(nèi)的脯氨酸大體上隨休眠進(jìn)程的深入而升高，到10月，由于低溫影響，狗牙根已經(jīng)完全進(jìn)入休眠階段，脯氨酸的積累可以幫助機(jī)體度過低溫逆境。狗牙根在休眠階段中，芽體內(nèi)可溶性蛋白大量積累。狗牙根芽體SOD活性有所上升，其原因可能是自身為了防御低溫，狗牙根即將進(jìn)入休眠時做出的應(yīng)對反應(yīng)。SOD活性減少，狗牙根已進(jìn)入休眠期，直到細(xì)胞膜失去活性，莖葉死亡。C130的POD活性值相對于其他地區(qū)狗牙根芽內(nèi)酶活性較高為2 059.26 U-1min-1不同的材料之間，芽體的膜質(zhì)抗氧化能力不同，芽體內(nèi)的細(xì)胞大多發(fā)生了膜脂過氧化，膜的通透性進(jìn)一步降低，生理生化反應(yīng)幾乎停滯，狗牙根已經(jīng)進(jìn)入休眠。

狗牙根芽休眠進(jìn)程與脯氨酸、抗氧化酶、可溶性蛋白等生理物質(zhì)的變化密切相關(guān)，狗牙根芽隨著溫度的降低，逐漸進(jìn)入休眠，脯氨酸、可溶性蛋白含量在大量積累，SOD、MDA含量下降，保持較低水平，可將游離脯氨酸和可溶性蛋白大量升高作為參考指標(biāo)判定休眠的起始。