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應(yīng)用RP-HPLC法測定野山杏果肉黃酮類化合物

2021-11-05 08:29戴小華谷虹霏金科旭束佳敏楊若藍吳夢嵐趙紅瓊
新疆農(nóng)業(yè)科學 2021年8期
關(guān)鍵詞:野山蘆丁槲皮素

戴小華,谷虹霏,金科旭,束佳敏,楊若藍,吳夢嵐,潘 慧,趙紅瓊

(新疆農(nóng)業(yè)大學,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】野山杏〔Armeniacasibirica(L.) Lam.〕果肉中含有多種黃酮類化合物,黃酮類化合物具有多種生物活性及藥理作用。近年來對黃酮及黃酮類化合物的不同分析檢測方法進行了多個研究,研究新疆野山杏總黃酮的提取分離方法,對開發(fā)利用新疆特色藥食同源植物提供有實際意義。【前人研究進展】高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)具有靈敏度高、流動相和色譜柱選擇范圍廣、分析速度快、流出組分易收集等特點[1],選擇該方法進行成分分析較普遍。張元梅等[2]研究利用高效液相法同時檢測柑橘果實中18種黃酮類化合物的含量,分離效果良好;左月明等[3]等采用RP-HPLC法在40 min內(nèi)梯度洗脫同時檢測出三白草藥材中蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物的含量;WANG等[4]在流速1.0 mL/min下梯度洗脫 25 min內(nèi)同時分離檢測冷蒿地上部分7種黃酮類化合物含量。【本研究切入點】關(guān)于野山杏黃酮及黃酮化合物的提取及分離方面報道較少。研究運用高效液相色譜法,建立一種簡便、快速、準確的測定方法?!緮M解決的關(guān)鍵問題】采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,分析檢測波長、流動相、流速、柱溫等因素確定色譜條件,運用系統(tǒng)適用性試驗、精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重復(fù)性實驗、加樣回收率實驗,驗證野山杏果肉中4種黃酮類化合物的含量分析方法。

1 材料與方法

Hubble C18(1.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;高效液相色譜系統(tǒng):島津LC-20A型高效液相色譜儀、SPD-20A型檢測器、SIL-20A型進樣器、LC-20AT型輸液泵、CTO-20A型柱溫箱(日本島津公司)。

野山杏果實采自新疆哈密地區(qū)伊吾縣,經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學食藥學院藥用植物實驗室鑒定為野山杏〔Armeniacasibirica(L.)Lam.〕的干燥果肉。蘆丁(批號Y22S6S3719,純度為98%)、原花青素(批號Y22F7Y17095,純度為95%)、槲皮素(批號C20J6Y1722,純度為98%)、柚皮苷二氫查爾酮(批號H05S6K3043,純度為98%)均購自上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、磷酸(分析純)。

1.2 方 法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 對照品溶液配制

稱取原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素4種對照品各(10.00±0.20)mg,用甲醇溶解并分別定容至25 mL容量瓶中,搖勻,即得對照品溶液。

1.2.1.2 混標儲備液

分別取上述溶液各2.50 mL,混合均勻,制得含有原花青素106.00 μg/mL、蘆丁103.00 μg/mL、柚皮苷二氫查爾酮112.00 μg/mL、槲皮素104.00 μg/mL的混標儲備液。

1.2.1.3 混標中間液及混標工作液

準確量取5 mL混標溶液甲醇定容至10 mL,制得含有原花青素53.00 μg/mL、蘆丁51.50 μg/mL、柚皮苷二氫查爾酮56.00 μg/mL、槲皮素52.00 μg/mL混標中間液。

分別取0.25、0.50、1.00、2.00 mL中間液甲醇定容至10 mL容量瓶,搖勻,配制標準工作液上機待測。

不同濃度的混合對照品溶液,采用優(yōu)化的色譜條件,測定新疆野山杏果肉中4種黃酮類化合物成分的峰面積,以各對照品溶液中黃酮成分濃度為橫坐標(x)、峰面積值為縱坐標(y),制作標準曲線圖并計算線性回歸方程。精密移取黃酮混合對照品,并連續(xù)6次進樣,測定峰面積并計算RSD值。取供試品溶液,供試品溶液6份,按優(yōu)化的色譜條件,分別于0、1、2、4、6、8 h測定峰面積。取同一供試品溶液,在色譜條件下,連續(xù)進樣6次,測定得到峰面積。以各待測成分峰面積為指標,計算原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積的RSD值。稱取野山杏果肉粉末1.0 g,制備供試品溶液,進樣量10 μL。按高、中、低3個濃度水平進行加樣回收實驗,且每個濃度平行3次。稱取6份同一野山杏果肉干燥粉末,制備供試品溶液。用微孔濾膜(0.22 μm)過濾并根據(jù)色譜條件進樣測定。

1.2.1.4 供試品溶液配制

取1 g野山杏干燥果肉,粉碎,過40目篩,加50%乙醇(料液比1∶50),70℃下超聲1 h,超聲提取2次,抽濾,合并濾液旋蒸濃縮后,用甲醇定容至10 mL,搖勻,制成供試品溶液,測定前用微孔濾膜(0.22 μm) 過濾,備用。圖1

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化

1.2.2.1 檢測波長選擇

取對照品溶液,采用二極管陣列檢測器對各成分吸收峰進行掃描,通過3D圖譜對各對照品的吸收峰進行分析,確定對照品溶液的最大吸收波長。

1.2.2.2 流動相選擇

黃酮類化合物都微溶于水,同時溶于有機溶劑,在C18色譜柱應(yīng)用中,選用甲醇-水溶液作流動相時分離黃酮類化合物效果最佳。根據(jù)待測物的理化性質(zhì)及文獻報道[5],采用甲醇-磷酸水溶液作為流動相。

1.2.2.3 流速選擇

在固定相和流動相不變的情況下,分析0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 4種不同流速下色譜峰分離情況。

1.2.2.4 柱溫選擇

在流動相和固定相不變的情況下,分別在25、30、35℃下,以出峰時間為測定依據(jù),分析不同柱溫對色譜峰的影響。

1.2.2.5 色譜條件

取各對照品溶液、供試品溶液、溶劑空白依次進樣,原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素4種黃酮類化合物均在270 nm左右有共同的吸收峰帶,經(jīng)分析比照后得到對照品混合溶液最大吸收波長為273 nm。圖1

Hubble C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,流動相A(甲醇)∶B(0.5%磷酸水溶液)=45∶55,以1.0 mL/min流速進行等度洗脫,柱溫箱溫度為35℃,檢測波長為273 nm,進樣量為10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、SigmaPlot 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性

研究表明,溶劑空白和對照品、樣品溶液無干擾作用,則檢測條件符合要求。圖4~6

圖2 不同流速下各黃酮成分保留時間變化Fig.2 Effect of different flow rateon the retention time of different flavonoids

圖3 不同溫度下各黃酮成分保留時間變化Fig.3 Effect of different temperature the retention time of different flavonoids

圖4 溶劑空白色譜峰Fig.4 Chromatogram of Solvent

注:1.原花青素;2.蘆?。?.柚皮苷二氫查爾酮;4槲皮素

注:1.原花青素;2.蘆?。?.柚皮苷二氫查爾酮;4槲皮素

2.2 標準曲線的制備

研究表明,野山杏果實中原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素在各自濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。表1

表1 標準曲線方程(n =6)Table 1 Quation of standard curve line(n=6)

2.3 精密度

研究表明,原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積分別為0.88%、0.14%、0.14%、0.44%(n=6)。表2

表2 精密度(n =6)Table 2 Result of Precision experiment(n=6)

2.4 穩(wěn)定性

研究表明,供試品溶液的色譜峰面積沒有明顯改變。原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積的RSD值分別為1.82%、0.77%、未檢出、1.93%(n=6),原花青素、蘆丁和槲皮素穩(wěn)定性良好。表3

表3 穩(wěn)定性(n =6)Table 3 Result of stability experiment(n=6)

2.5 重復(fù)性

研究表明,原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積的RSD值分別為1.88%、2.69%、未檢出、3.31%(n=6),該方法檢測原花青素、蘆丁和槲皮素重復(fù)性較好。表4

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果(n =6)Table 4 Result of reproducibility experiment(n=6)

2.6 加樣回收率

研究表明,除柚皮苷未檢出,槲皮素低、中組未檢出,各黃酮類化合物成分的加樣回收率在92.13%~96.70%,黃酮類化合物成分原花青素和蘆丁的回收率良好。表5

2.7 樣品含量

研究表明,新疆野山杏果肉中4種黃酮類化合物成分的含量,其中柚皮苷未檢出,槲皮素、原花青素、蘆丁含量不等,其中原花青素含量最高。表6

表5 樣品加標回收率(n =3) Table 5 Result of recovery experiment(n=3)

表6 野山杏果肉黃酮成分含量(n =6)Table 6 Result of component content determination of flavonoids in TFWA(n=6)

3 討 論

野山杏果肉中含有豐富的黃酮類化合物,但不同地區(qū)以及不同部位黃酮的含量和種類有一定差異,用RP-HPLC法分析野山杏黃酮類成分的報道較少。閆偉偉等[6]建立了杏花藥材(HPLC)指紋圖譜測定方法并對不同產(chǎn)地的杏花藥材進行質(zhì)量評價,張麗麗等[7]采用高效液相色譜法測定了5個杏品種果肉中的可溶性糖和有機酸,張玲等[8]采用HPLC定量分析方法對3個仁用杏品種杏仁中的苦杏仁苷質(zhì)量分數(shù)進行了檢測, 韓海霞等[9]利用HPLC法測定了新疆巴旦杏中苦杏仁苷的含量;羅慧玉等[10]利用HPLC法測定了杏花中阿魏酸、蘆丁和異槲皮苷的含量,其中蘆丁的含量為3.080~6.933 mg /g,張元梅等[11]研究利用高效液相法同時檢測柑橘果實中18種黃酮類化合物的含量,具有良好的分離效果。左月明等[12]等采用RP-HPLC法在40 min內(nèi)梯度洗脫同時檢測出三白草藥材中蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物的含量。實驗測定的蘆丁含量高于文獻報道的,故進一步說明不同部位黃酮的含量和種類有一定差異。

在對流動相進行選擇時,實驗初步選擇水-甲醇系統(tǒng)作為流動相,混合對照品溶液中各成分色譜峰分離效果不佳,后加入磷酸進行調(diào)節(jié),直到調(diào)節(jié)到流動相V甲醇∶V 0.5%磷酸溶液=45∶55時,4種黃酮類化合物成分色譜峰在20 min內(nèi)完全分離,峰形對稱且分離度良好。

實驗中測定的4種成分為3種不同類型的黃酮類化合物,即黃酮醇類、查爾酮類、花色素類,如若要測定野山杏更多類型的黃酮類化合物可在實驗流動相為V甲醇∶V 0.5%磷酸溶液=45∶55的基礎(chǔ)上,調(diào)節(jié)流動相配比,必要時進行梯度洗脫,就可進一步建立測定分析野山杏多種黃酮化合物成分及含量的方法。

在各黃酮類化合物成分的含量檢測中,由于柚皮苷二氫查爾酮在野山杏中含量極低,低于檢測限,故在含量檢測時未檢出,在研究過程中進一步探討同時測定柚皮苷二氫查爾酮含量的最優(yōu)條件。

4 結(jié) 論

采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素等4種黃酮類化合物,其中原花青素、蘆丁、槲皮素3種黃酮成分色譜峰在20 min內(nèi)分離度良好,線性范圍為0.52~56 μg/mL(r= 0.999 8~1),加樣回收率為92.13%~96.70%,RSD為0.89%~1.96%,在該條件下測得的原花青素的含量為7.325 mg/kg,蘆丁的含量為0.630 mg/kg,槲皮素的含量為0.009 58 mg/kg,3種黃酮類化合物中原花青素含量最高;一種黃酮類化合物即柚皮苷二氫查爾酮在該條件下未檢出。RP-HPLC法可對新疆野山杏果肉中3種黃酮類化合物成分進行分析,該法簡便、準確、快速、穩(wěn)定性及重復(fù)性好,可為野山杏中黃酮類化合物的快速檢測提供實驗依據(jù)。

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