張宸瑞，薛橋麗，白彬陽，胡永金,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，云南 昆明 650201）

腐乳作為我國特有的大豆發(fā)酵食品，其風(fēng)味醇厚、濃香，口感滑潤、細(xì)膩，營養(yǎng)豐富[1]。云南牟定縣地理環(huán)境優(yōu)越，氣候適宜，從明末清初時(shí)期生產(chǎn)腐乳，隨著生產(chǎn)工藝不斷精進(jìn)，其口感、風(fēng)味不斷豐富，如今牟定腐乳遠(yuǎn)近聞名，成為云南腐乳的代表[2]。

牟定腐乳的獨(dú)到生產(chǎn)工藝為酸漿水點(diǎn)漿，酸漿水是豆腐壓制過程中滲出的黃漿水經(jīng)乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等微生物[3-4]發(fā)酵形成。自然環(huán)境中的微生物接觸黃漿水后，以黃漿水中的蛋白碎片、纖維碎片、多糖等大量營養(yǎng)物質(zhì)作為營養(yǎng)源，通過酶解代謝產(chǎn)生大量醋酸、乳酸、草酸等幾十種有機(jī)酸，因此溶液整體酸價(jià)下降[5-6]成為豆腐點(diǎn)漿的酸漿水。酸漿水作為天然凝固劑不僅避免引入無機(jī)金屬離子，還賦予腐乳獨(dú)特風(fēng)味，最大限度地開發(fā)黃漿水的應(yīng)用效率，極大地減少黃漿水排放造成的環(huán)境污染[7-8]。但由于自然引入的微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有益菌的同時(shí)也摻雜有害微生物，導(dǎo)致產(chǎn)品存在安全隱患[9]。自然發(fā)酵的酸漿水受外界環(huán)境因素影響較大，難以保證每個(gè)批次的穩(wěn)定品質(zhì)，因此從自然發(fā)酵的酸漿水中分離優(yōu)勢菌群，分析菌群的生長特性以篩選生長繁殖快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，采用分離篩選的純種菌發(fā)酵黃漿水即可解決上述問題。

目前，國內(nèi)外對(duì)酸漿水中微生物的研究主要集中于篩選鑒定優(yōu)勢乳酸菌、分析生長特性及測定代謝 產(chǎn)物[10-11]，對(duì)酸漿水中的其他高產(chǎn)酸菌株及其特性研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)分離、篩選、鑒定云南牟定2 家腐乳生產(chǎn)公司自然發(fā)酵酸漿水中的高產(chǎn)酸菌株，并通過生長特性研究明確不同高產(chǎn)酸菌株的生長條件及產(chǎn)酸性能，從中篩選生長迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，以期為綜合利用高產(chǎn)酸菌發(fā)酵生產(chǎn)提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿水樣品 云南牟定兩家腐乳生產(chǎn)公司（A、B公司）；改良MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基 上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；增強(qiáng)革蘭氏染色液 北京雷根生物有限公司；新型生化鑒定管 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司； 無水碳酸鈣、鹽酸、氯化鈉（均為分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；納他霉素（食品級(jí)） 浙江新銀象生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCM-1000A超凈工作臺(tái) 蘇州安泰技術(shù)有限公司； Eppendorf移液槍 南京貝登醫(yī)療股份有限公司；9053A烘箱 上海實(shí)研電爐有限公司；HHPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Nikon E200-F顯微鏡 南京新飛達(dá)光學(xué)儀器公司；LX-B高壓蒸汽滅菌鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TF-B60超低溫冰箱 上海賽默飛世爾科技公司；pH-10 pH計(jì) 廣州市銘睿電子科技有限公司；725N分光光度計(jì) 南京曉曉儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酸菌的分離

采用平板涂布法，將稀釋后的酸漿水樣品涂布于添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%納他霉素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%碳酸鈣的MRS分離培養(yǎng)基上[12]，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，挑取有溶鈣圈的單菌落純化3 代，轉(zhuǎn)接于斜面4 ℃保存。

1.3.2 高產(chǎn)酸菌的篩選

挑取保存菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，以總酸含量為指標(biāo)，產(chǎn)酸量高于20 g/L的菌株為高產(chǎn)酸菌株?？偹釡y定參考王嘉琪等[13]的方法，以乳酸計(jì)，按下式計(jì)算待測液產(chǎn)酸量：

式中：C為待測液產(chǎn)酸量/（g/L）；C1為標(biāo)定的氫氧化鈉濃度/（mol/L）；M為乳酸摩爾質(zhì)量/（g/mol）； N為稀釋倍數(shù)（10）；V1為樣品待測液消耗氫氧化鈉溶液體積/mL；V2為空白待測液消耗氫氧化鈉溶液體積/mL；V3為樣品待測液體積/mL。

1.3.3 高產(chǎn)酸菌株的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

用革蘭氏染色法對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察[14]。將菌株制成菌懸液接入生理生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察記錄顏色變化，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]進(jìn)行判定。

1.3.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

將菌株送至北京擎科生物科技有限公司，進(jìn)行DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及16S rDNA測序。

將獲得的測序結(jié)果提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫通過BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定種屬及親緣關(guān)系并進(jìn)行ITS同源性分析，選取同源性高的菌株16S rDNA基因序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建發(fā)育樹。

1.3.5 自然發(fā)酵酸漿水及高產(chǎn)酸菌株的活化

將低溫保藏不同產(chǎn)地的的酸漿水樣品按體積分?jǐn)?shù)3%接入MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫發(fā)酵24 h，連續(xù)培養(yǎng)2 代，獲得活化酸漿水發(fā)酵液，將A公司活化酸漿水命名為Y，B公司活化酸漿水命名為X。用接種環(huán)挑取試管斜面保藏高產(chǎn)酸菌株分別接入MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫發(fā)酵24 h，取3%發(fā)酵24 h的純菌種發(fā)酵液接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫發(fā)酵24 h，連續(xù)培養(yǎng)2 代以獲得活化高產(chǎn)酸菌發(fā)酵液。

1.3.6 生長曲線測定

取活化后的酸漿水發(fā)酵液、純菌種發(fā)酵液均按體積分?jǐn)?shù)3%分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫發(fā)酵48 h，每隔4 h取發(fā)酵液，以滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，采用分光光度計(jì)測定發(fā)酵液OD600nm值，重復(fù)測定3 次[16]。

1.3.7 產(chǎn)酸能力測定

取活化后的酸漿水發(fā)酵液、純菌種發(fā)酵液均按體積分?jǐn)?shù)3%分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫發(fā)酵48 h，每隔4 h取發(fā)酵液作為待測液，測定總酸量及pH值，pH值用pH計(jì)測定，總酸測定同1.3.2節(jié)方法。

1.3.8 高產(chǎn)酸菌耐酸能力測定

取活化后的自然發(fā)酵酸漿水和純菌種發(fā)酵液，按3%接種量分別接入初始pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h測定OD600nm值，重復(fù)測定3 次。

1.3.9 耐滲透壓能力測定

取活化后的酸漿水發(fā)酵液和純菌種發(fā)酵液，按體積分?jǐn)?shù)3%分別接入NaCl質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10、12、14 g/100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h測定OD600nm值，重復(fù)測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、Origin 9.0進(jìn)行繪圖，MEGA 7.0進(jìn)行同源性分析及建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 牟定腐乳酸漿水中產(chǎn)酸菌的篩選與鑒定

2.1.1 產(chǎn)酸菌的初篩

由于產(chǎn)酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸與培養(yǎng)基環(huán)境中的不溶性碳酸鈣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成溶解度較大的乳酸[17]，產(chǎn)生肉眼可見的透明溶鈣圈，因此選取產(chǎn)生溶鈣圈效果明顯的菌落于MRS固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線并分離、純化，獲得80 株產(chǎn)酸特征明顯的單菌落并進(jìn)行4 ℃試管斜面保存。

2.1.2 高產(chǎn)酸菌的復(fù)篩

將80 株產(chǎn)酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸性能測定，分離自云南牟定A公司酸漿水中的10 株菌產(chǎn)酸量均高于20 g/L，分離自云南牟定B公司酸漿水中的8 株菌產(chǎn)酸量均高于20 g/L。

2.1.3 菌株的初步鑒定

對(duì)18 株高產(chǎn)酸菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，獲得10 株不同菌群特征、菌體特征的的革蘭氏陽性菌，對(duì)云南牟定A公司酸漿水中分離獲得的高產(chǎn)酸菌株重新編號(hào)為YQZ1～YQZ5，將活化酸漿水內(nèi)自然菌群Y、YQZ1～YQZ5統(tǒng)稱為Y組，對(duì)云南牟定B公司酸漿水中分離獲得的高產(chǎn)酸菌株重新編號(hào)為QJZ1～QJZ5，將活化酸漿水內(nèi)自然菌群X、XJZ1～XJZ5統(tǒng)稱為X組。

參閱《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[18]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[19]，根據(jù)生化鑒定結(jié)果比對(duì)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]確定菌株YQZ1、YQZ3、XJZ2、XJZ3、XJZ5為乳桿菌屬（Lactobacillus），菌株YQZ4、XJZ1、XJZ4為腸球菌屬（Enterococcus），菌株YQZ2為乳球菌屬（Lactococcus），菌株YQZ5為微桿菌屬（Microbacterium）。

2.1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定及發(fā)育樹建立

2.1.4.1 菌株基因序列測定

以10 株菌的DNA為模板，以27F、1492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%尿蛋白普通瓊脂糖凝膠電泳，16S rDNA PCR電泳結(jié)果如圖1所示，10 菌株16S rDNA序列長度在1 500 bp有較清晰、明亮的特異性條帶，可進(jìn)行基因序列測定[20]。

圖1 10 株菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of the PCR amplified products of 16S rDNA gene from 10 strains

2.1.4.2 菌株同源性分析及發(fā)育樹建立

將10 株產(chǎn)酸菌株測定結(jié)果錄入NCBI的BLAST程序上同源性分析比對(duì)，結(jié)果如表1所示。根據(jù)形態(tài)學(xué)分析、生理生化測定結(jié)果，結(jié)合同源性比對(duì)，確立菌株YQZ1～YQZ5分別為發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）、棉子糖乳球菌（L. raffinolactis）、植物乳桿菌 （L. plantarum）、鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）、氧化微桿菌（M. oxydans），菌株XJZ1～XJZ5分別屎腸球菌（E. faecium）、L. plantarum、副干酪乳桿菌 （L. paracasei）、海氏腸球菌（E. hirae）、L. paracasei。10 株菌中乳酸菌有6 株、腸球菌有3 株、微桿菌有1 株，可確定乳酸菌為酸漿水中主要菌群。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，采用Clustalx裁剪基因序列，采用MAGE7.0對(duì)修剪后的基因序列建立發(fā)育樹，10 株菌系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2、3所示。

表1 10 株菌株同源性分析Table 1 Homology analysis of 10 strains

圖2 YQZ1～YQZ5菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strains YQZ1-YQZ5

圖3 XJZ1～XJZ5菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strains XJZ1-XJZ5

2.2 產(chǎn)酸菌的生長特性分析

2.2.1 產(chǎn)酸菌生長曲線分析

如圖4所示，不同產(chǎn)地酸漿水中的自然菌群在不同生長周期內(nèi)相較于大部分單菌株有一定生長優(yōu)勢。自然菌群Y、X在短時(shí)間能迅速進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期，且對(duì)數(shù)生長期的生長速率明顯高于大多數(shù)菌株，說明自然菌群具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和較高的繁殖速率。自然菌群Y、X在8 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，且整個(gè)生長穩(wěn)定期均保持較高菌體濃度（OD600nm），其濃度基本穩(wěn)定在2.2，未出現(xiàn)較大幅度的波動(dòng)，說明自然菌群具有較強(qiáng)的繁殖能力，且種間不具有多重競爭關(guān)系。Y組包含的自然菌群Y、菌株YQZ3在0～8 h呈對(duì)數(shù)生長，菌株YQZ1、YQZ4在0～16 h呈對(duì)數(shù)生長，菌株YQZ2在0～24 h呈對(duì)數(shù)生長，YQZ2較其他菌株的對(duì)數(shù)生長周期較長，且生長速率較緩。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，菌株YQZ1生長速率僅次于Y、YQZ3，但繁殖能力最強(qiáng)，48 h時(shí)菌體濃度為2.26，自然菌群Y次之，YQZ2菌體濃度最低。X組包含的菌株XJZ2、XJZ4、自然菌群X在0～8 h呈對(duì)數(shù)生長，菌株XJZ5在0～12 h呈對(duì)數(shù)生長，菌株XJZ1、XJZ3在0～16 h呈對(duì)數(shù)生長。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)菌株XJZ2生長速率最快、活菌數(shù)目最高，48 h菌體濃度2.44，自然菌群X次之，XJZ4最低，因此菌株YQZ1、XJZ2均有非常理想的生長繁殖能力。

圖4 產(chǎn)酸菌株Y組（a）、X組（b）生長曲線圖Fig. 4 Growth curves of acid-producing strains from group Y (a) and group X (b)

2.2.2 菌株產(chǎn)酸性能分析

由圖5可知，菌群、菌株的產(chǎn)酸速率與生長趨勢呈正相關(guān)，即生長速度越快，產(chǎn)酸速率越快，尤其是處于生長對(duì)數(shù)期的菌株，能快速吸收培養(yǎng)基中的原營養(yǎng)物質(zhì)和分解后的次級(jí)營養(yǎng)物質(zhì)以代謝產(chǎn)酸，短時(shí)間內(nèi)有機(jī)酸的累積量迅速增加。處于生長穩(wěn)定期的菌株出生率和死亡率已逐漸達(dá)到平衡，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗率和代謝率基本穩(wěn)定，該階段產(chǎn)酸速率較對(duì)數(shù)生長期的產(chǎn)酸率緩慢，但酸累積量穩(wěn)步上升，于第48小時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。自然菌群Y、X在0～16 h代謝產(chǎn)酸速率高，多種微生物能夠在初始營養(yǎng)環(huán)境中最大限度地吸收各種營養(yǎng)滿足自身生長，不同菌株之間可能存在一定互生關(guān)系，更利于彼此生長代謝，進(jìn)一步提高產(chǎn)酸速率。自然菌群Y、X的乳酸積累量分別在28～48、20～32 h出現(xiàn)下降，其原因可能為以有機(jī)酸為次生碳源的菌群在該階段生長活躍，有機(jī)酸分解代謝率高于產(chǎn)酸率，導(dǎo)致酸累積量下降，因此自然菌群中的乳酸累積并不穩(wěn)定。從Y組可知，0～48 h內(nèi)YQZ1的酸累積量最多，但在24～40 h產(chǎn)酸量大幅度下降后回升的原因可能為乳酸、乙酸、酒石酸代謝轉(zhuǎn)化為其他小分子產(chǎn)物，隨后又繼續(xù)累積，有機(jī)酸累積量最高，最終產(chǎn)酸量為43.61 g/L。菌株YQZ4產(chǎn)酸速率較低，且產(chǎn)酸量最少，最終產(chǎn)酸量為25.21 g/L。由X組可知，自然菌群X的產(chǎn)酸量在20～36 h先下降后回升，其他菌株菌基本保持較為穩(wěn)定的遞增趨勢，XJZ2產(chǎn)酸速率最快，有機(jī)酸累積量最多，最終產(chǎn)酸量為50.91 g/L，菌株XJZ1的最終產(chǎn)酸量僅次于XJZ2，最終產(chǎn)酸量為49.93 g/L，菌株XJZ4產(chǎn)酸速率最慢，最終產(chǎn)酸量為34.68 g/L。從圖6可知，菌群的pH值在發(fā)酵初期隨著有機(jī)酸的快速累積，氫離子濃度的迅速升高而快速降低，隨之緩慢降低直至趨于平穩(wěn)，Y組的自然菌Y、菌株YQZ1、YQZ2、YQZ3、YQZ4、YQZ5的最終pH值為3.98、3.75、3.84、4.01、3.98、4.02。X組的自然菌群X、菌株XJZ1、XJZ2、XJZ3、XJZ4、XJZ5的最終pH值為3.79、3.54、3.48、3.53、3.98、3.49。由圖5、6可知，隨YQZ1、XJZ2的產(chǎn)酸能力明顯高于其他菌株。

圖5 產(chǎn)酸菌株Y組（a）、X組（b）的產(chǎn)酸量Fig. 5 Acid-producing capacity of acid-producing strains from group Y (a) and group X (b)

圖6 產(chǎn)酸菌株Y組（a）、X組（b）的pH值變化趨勢Fig. 6 pH trends of acid-producing strains from group Y (a) and group X (b)

產(chǎn)酸能力是衡量產(chǎn)酸菌發(fā)酵活力的重要指標(biāo)，決定著發(fā)酵周期的長短。發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機(jī)酸不僅抑制部分有害微生物的生長繁殖[21]，而且對(duì)酸漿風(fēng)味形成及酸漿豆腐的品質(zhì)和風(fēng)味均有重要影響[22]。僅X組菌株XJZ2產(chǎn)酸量高于50 g/L。Y組菌株YQZ1、YQZ2和X組菌株XJZ3的產(chǎn)酸量在40～50 g/L之間。Y、X組產(chǎn)酸量平均值為34.46、46.41 g/L，均高于葉青[23]優(yōu)化后的最高產(chǎn)酸量34.25 g/L，2 組菌株從整體上表現(xiàn)較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，具有深入研究價(jià)值。

2.2.3 產(chǎn)酸菌耐酸性能分析

采用一定酸度的酸漿水點(diǎn)漿是大豆蛋白是否能夠酸凝、豆腐壓榨成型后能否保持一定品質(zhì)的關(guān)鍵，因此產(chǎn)酸菌應(yīng)該具有一定耐酸能力以保證酸漿酸度達(dá)到點(diǎn)漿要求及后續(xù)工藝順利進(jìn)行。

如圖7所示，隨pH值下降，菌體濃度呈現(xiàn)不同幅度的降低，相同pH值表現(xiàn)不同的耐受能力。自然菌群在pH 3.5～4.5的最佳點(diǎn)漿酸度范圍內(nèi)[24-25]，相較于其他菌株表現(xiàn)較為脆弱的生長趨勢，自然菌群Y、X的活菌數(shù)下降幅度明顯，其原因可能為自然菌群中的大部分耐酸能力較差的菌群隨酸度下降的生長受到明顯抑制，因此整體體現(xiàn)較差的耐酸性。從Y組可知，菌株YQZ3、YQZ5的耐酸性最強(qiáng)，pH 2.5的菌體濃度仍保持在1.64、1.39的較高水平。菌株YQZ1在pH 4.0時(shí)生長狀況保持良好，培養(yǎng)24 h后，菌體濃度為1.47。當(dāng)pH值降至3.0時(shí)，YQZ1、YQZ2、YQZ4菌體濃度下降明顯，pH值低于2.5則幾乎不生長，其原因可能為pH值過低，環(huán)境中的氫離子濃度過高，菌株無法維持細(xì)胞內(nèi)的電荷平衡，導(dǎo)致生長受到抑制，甚至死亡。從X組可知，pH值降至3.5前，XJZ2菌株耐酸能力始終高于其他菌株，pH 3.5時(shí)仍能保持最高繁殖能力，XJZ4菌株耐酸性最差，當(dāng)pH值降至4.0時(shí)，菌體濃度僅為0.31。因此菌株YQZ1、YQZ3、YQZ5、XJZ2具有較好的耐酸能力。

圖7 產(chǎn)酸菌株Y組（a）、X組（b）的耐酸性Fig. 7 Acid tolerance of acid-producing strains from group Y (a) and group X (b)

2.2.4 產(chǎn)酸菌耐滲透壓能力分析

微生物的生長繁殖需理想的滲透壓境條件，滲透壓過大會(huì)抑制微生物的生長繁殖，甚至脫水衰竭[26-27]。產(chǎn)酸菌株的耐鹽性結(jié)果如圖8所示。自然菌群雖具有一定豐度，各類微生物參與整個(gè)代謝環(huán)境，但隨著鹽質(zhì)量濃度的增加，并未體現(xiàn)理想的耐受性和生存能力，NaCl質(zhì)量濃度由0 g/100 mL增至4 g/100 mL時(shí)，活菌數(shù)大幅度下降，8 g/100 mL NaCl的菌落基本停止生長，其活菌數(shù)遠(yuǎn)小于不含NaCl培養(yǎng)基內(nèi)的活菌數(shù)。由Y組可知，菌株YQZ2、YQZ3耐受性最弱，4 g/100 mL NaCl或6 g/100 mL NaCl條件下，菌落的生命活動(dòng)受到明顯抑制；NaCl質(zhì)量濃度大于6 g/100 mL時(shí)，菌落無法生長而死亡。4 g/100 mL NaCl條件下菌株YQZ4生長良好，活菌數(shù)最高，培養(yǎng)24 h時(shí)，其OD600nm為1.53，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度大于4 g/100 mL時(shí)，生長受到明顯抑制，但在NaCl質(zhì)量濃度為10 g/100 mL時(shí)仍能存活。X組菌株整體耐鹽性較差，菌株XJZ3、XJZ5對(duì)鹽的耐受性最差，4 g/100 mL NaCl條件下基本不生長。菌株XJZ2在NaCl質(zhì)量濃度由4 g/100 mL增至8 g/100 mL時(shí)表現(xiàn)理想的耐鹽性，活菌數(shù)下降幅度小，8 g/100 mL NaCl條件下仍能夠存活。因此菌株YQZ4具有非常理想的耐鹽性。

圖8 產(chǎn)酸菌株Y組（a）、X組（b）的耐鹽性Fig. 8 Salt tolerance of acid-producing strains from group Y (a) and group X (b)

3 討 論

乳酸菌是有重要生理功能的益生菌，廣泛分布于乳制品、腌制肉類、泡菜醬菜等各類發(fā)酵食品中，乳酸菌發(fā)酵不僅能夠產(chǎn)生酸乳酸、甲酸、乙酸、γ-氨基丁酸等賦予食物獨(dú)特的風(fēng)味，而且大部分還能產(chǎn)生乳酸菌素，抑制甚至殺死許多導(dǎo)致食物腐敗、變質(zhì)的致病菌，不影響食物的品質(zhì)風(fēng)味，且延長食物的貯藏保鮮期[28-29]。目前國內(nèi)外對(duì)酸漿水中的優(yōu)勢乳酸菌已有諸多研究[4,30-33]。Qiao Zhihong等[4]通過研究酸漿水中的不同有機(jī)酸含量得出乳酸菌為酸漿水中優(yōu)勢菌群的結(jié)論。Xu Yunhe等[30]通過高通量測序及研究大豆蛋白凝固機(jī)理，獲得1 株凝乳能力強(qiáng)、產(chǎn)酸量大的干酪乳桿菌YQ336。Fei Yongtao等[31]優(yōu)化酸水中分離獲得菌株的發(fā)酵條件，獲得酸度值為110 °T的淀粉乳桿菌L6。本研究經(jīng)分離篩選鑒定、生長特性研究獲得產(chǎn)酸量高達(dá)50.91 g/L的菌株XJZ2，是佟梓沂等[32]從酸漿水中分離得到的植物乳桿菌培養(yǎng)48 h產(chǎn)酸量40.80 g/L的1.25 倍。分離獲得產(chǎn)酸量高達(dá)43.61 g/L的菌株YQZ1，其產(chǎn)酸性能強(qiáng)于賀云[33]從酸漿水分離得到的發(fā)酵乳桿菌。菌株XJZ2、YQZ1均有理想的產(chǎn)酸能力，均能大幅縮短酸漿水發(fā)酵周期、提高經(jīng)濟(jì)效益、發(fā)揮潛在應(yīng)用價(jià)值。

腸球菌常見于乳制品、發(fā)酵肉制品、腸道內(nèi)及糞便中，酸漿水中鮮見報(bào)道[34-36]。M. oxydans多從土壤中分離獲得[37]，酸漿水中未有報(bào)道。本研究從酸漿水中分離到3 株高產(chǎn)酸腸球菌，1 株微桿菌。菌株XJZ1（E. faecium）產(chǎn)酸量49.90 g/L，耐酸性較理想的菌株YQZ5（M. oxydans）產(chǎn)酸量31.59 g/L。本研究證明酸漿水中的優(yōu)勢菌群除乳酸菌外，還有其他產(chǎn)酸性能力強(qiáng)的菌群，其均對(duì)增加酸漿水酸度發(fā)揮重要作用，對(duì)酸漿水風(fēng)味的形成可能具有重要影響。因此還需進(jìn)一步研究3 株腸球菌、M. oxydans與乳酸菌協(xié)同發(fā)酵黃漿水的代謝機(jī)制、對(duì)人體有潛在危害代謝物、具有重要生理活性功能的代謝物及其對(duì)酸漿水風(fēng)味的影響，以為改善酸漿豆腐品質(zhì)、口感提供理論參考。

4 結(jié) 論

為探明云南牟定酸漿水中優(yōu)勢產(chǎn)酸菌株及其生長特性、高效應(yīng)用黃漿水、減少排放污染，本實(shí)驗(yàn)從云南牟定A、B公司自然發(fā)酵酸漿水中分離篩選到10 株高產(chǎn)酸菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列測定分析、同源性比對(duì)及發(fā)育樹的構(gòu)建。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)，可將10 株菌可分乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、微桿菌屬。將10 株菌進(jìn)行16S rDNA序列測定分析及同源性比對(duì)得到菌株YQZ1為L. fermentum、菌株YQZ2為L. raffinolactis、菌株YQZ3為L. plantarum、菌株YQZ4為E. casseliflavus、菌株YQZ5為M. oxydans、菌株XJZ1為E. faecium、菌株XJZ2為L. plantarum、菌株XJZ3為L. paracasei、菌株XJZ4為 E. hirae、菌株XJZ5為L. paracasei。10 株高產(chǎn)酸菌種乳酸菌6 株、腸球菌3 株、微桿菌1 株，因此可確定乳酸菌為云南牟定酸漿水中優(yōu)勢菌群。

10 株菌及自然菌群的生長溫度、生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸能力的分析結(jié)果表明，菌株XJZ4最適生長溫度為32 ℃，其余菌株的最適生長溫度均為37 ℃。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，菌株XJZ2生長速率最大，菌株YQZ1、XJZ2繁殖能力最強(qiáng)；產(chǎn)菌株YQZ1、XJZ2產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，有機(jī)酸累積量最多，培養(yǎng)至20 h時(shí)pH值分別降至3.80、3.58，二者于48 h產(chǎn)酸量分別高達(dá)43.61、50.91 g/L；菌株YQZ3、YQZ5的耐酸性最強(qiáng)；菌株YQZ1、XJZ2耐酸性良好，在pH 4.0時(shí)仍能保持菌體濃度高于1.00；菌株YQZ4耐鹽性最強(qiáng)，菌株YQZ4在4 g/100 mL NaCl條件下仍能保持菌體濃度1.53，其余菌株在NaCl質(zhì)量濃度大于4 g/100 mL時(shí)生長受到明顯抑制；通過生長特性分析，菌株YQZ1、XJZ2均具有較強(qiáng)的繁殖能力和較高的產(chǎn)酸性能，二者可用于后續(xù)混合菌種發(fā)酵黃漿水研究。