黃 艷，劉佳惠，侯嘉欣，呂 敏，陳 楠

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

蛋白酶是生物體內(nèi)的主要生物催化劑，能夠有效地催化一系列生物化學(xué)反應(yīng)，維持生物正常的代謝和生理活動(dòng).近年來，越來越多的證據(jù)表明，一些蛋白酶可以作為疾病診斷和治療的重要手段［1-2］.例如，2019年CHANG等［3］設(shè)計(jì)了一種前蛋白療法，通過一種新型脂質(zhì)納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)傳遞醌丙酸修飾的核糖核酸酶（RNase A-QPN），利用疾病細(xì)胞中內(nèi)源性的酶來激活蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用.2020年LIU等［4］開發(fā)一種具有選擇性捕獲肺癌細(xì)胞的月牙微凝膠，在凝膠基質(zhì)中包含葡萄糖氧化酶（GO x），在生理濃度的葡萄糖中會(huì)產(chǎn)生高濃度的過氧化氫（H2O2），殺死90%包裹在微凝膠腔內(nèi)的癌細(xì)胞.與小分子藥物和核酸藥物相比，蛋白質(zhì)藥物具有諸多優(yōu)勢(shì)［5-6］.首先，蛋白質(zhì)具有高度特異性和專一性，在正常的生理過程下通常不會(huì)引起不良反應(yīng).其次，一些天然蛋白質(zhì)生物安全性好，人體對(duì)其耐受性高，能夠避免引起免疫反應(yīng).最后，蛋白質(zhì)藥物不存在引發(fā)基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，是一種安全有效的治療方法.但是蛋白質(zhì)藥物也存在一些缺點(diǎn)，例如，在體內(nèi)環(huán)境中不穩(wěn)定、易失活、難進(jìn)細(xì)胞等，阻礙其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用［7］.

為了解決蛋白質(zhì)的遞送問題，人們構(gòu)建了形形色色具有空間封閉性的納米反應(yīng)器，用于運(yùn)載蛋白質(zhì)，保持蛋白質(zhì)活性以及提高反應(yīng)效率［8］.目前，這些納米反應(yīng)器已被應(yīng)用在多個(gè)研究領(lǐng)域，包括有機(jī)合成、催化氧化、傳感檢測(cè)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用等［9-10］.例如，ZHANG等［11］將GO x、二氧化錳（MnO2）和透明質(zhì)酸（HA）組裝成具有MnO2馬達(dá)的納米系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過GO x消耗葡萄糖達(dá)到腫瘤饑餓治療的效果.2020年，JO等［12］構(gòu)建了一種裝載GO x的溶瘤納米反應(yīng)器平臺(tái)，該納米反應(yīng)器不僅保護(hù)GO x免受蛋白水解，還提高酶的熱穩(wěn)定性；通過消耗細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和氧氣產(chǎn)生H2O2，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡.然而，大多數(shù)負(fù)載GO x的納米材料存在負(fù)載效率低、制備過程繁瑣、蛋白活性損傷等局限性［13-17］.因此，有必要構(gòu)建一種高負(fù)載、高活性的納米載體，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行探索研究.

近年來，金屬-有機(jī)骨架材料（MOF）因其具有高比表面積、剛性結(jié)構(gòu)、大孔隙率和較高生物安全性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種理想的藥物載體［18-19］.與傳統(tǒng)MOF合成工藝相比，本工作合成的以蛋白質(zhì)作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的沸石型金屬-有機(jī)框架材料（ZPF）是在水相中完成的，合成條件溫和，極大地保護(hù)了蛋白質(zhì)的活性，操作簡單省時(shí)，蛋白質(zhì)的負(fù)載率較高［20］.

本文作者以GO x為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向，構(gòu)建了納米反應(yīng)器（GO x＠ZPF）.該納米反應(yīng)器的蛋白負(fù)載率高，穩(wěn)定性及分散性好，且酶活性保持良好.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該GO x＠ZPF可以進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，定位在溶酶體，通過消耗細(xì)胞內(nèi)葡萄糖產(chǎn)生H2O2，抑制腫瘤細(xì)胞.綜上所述，GO x＠ZPF的構(gòu)建為細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白提供了一種全新的策略.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

GO x、辣根過氧化物酶（HRP）、2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCHF-DA）和3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）均購自Sigma-Aldrich公司；2-羥基嘧啶購自上海畢得醫(yī)藥公司；硝酸鋅六水合物購自上海探索平臺(tái)；熒光染料NHS-488、溶酶體染料lysotrack green購自Life Technology公司；1640培養(yǎng)基（有糖：+Glucose，無糖：-Glucose）和胎牛血清（FBS）購自Gibco Invitrogen公司；細(xì)胞核染料Hocest33342購自碧云天公司；超純水用Aquapro系統(tǒng)（18 MΩ·cm）制備.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

透射電子顯微鏡（TEM），JEOL 2100；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM），Hitachi S-4800；動(dòng)態(tài)光散射分析儀（DLS），Malvern Nano-ZS90；紫外分光光度儀，Shimadzu UV-1800；超速離心機(jī)，Beckman Coulter DU 730；熒光分光光度儀，F(xiàn)-7000；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR），Nicolet iS5；酶標(biāo)儀，Thermo Multiskan MK3；激光共聚焦顯微鏡，Leica TCS SP8；pH計(jì)，MSC-100杭州奧盛儀器有限公司；離心機(jī)，Eppendorf Centrifuge 5424 R；超聲機(jī)，XM300UHP；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Scientific BB150.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GO x＠ZPF的合成

1 mL的GO x溶液（2 mg·mL-1）加入2-羥基嘧啶充分溶解后，向混合液中加入硝酸鋅六水合物，嘧啶與硝酸鋅物質(zhì)的量之比為3∶1，充分混勻后，室溫靜置30 min.離心得到GO x＠ZPF.

1.3.2 GO x＠ZPF的表征

DLS表征GO x＠ZPF的水合半徑和Zeta電位；在6 d內(nèi)測(cè)定其水合粒徑確定材料的穩(wěn)定性.TEM和FE-SEM來表征GO x＠ZPF的形貌.考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法評(píng)估GO x＠ZPF中蛋白質(zhì)的負(fù)載率，通過計(jì)算得出反應(yīng)器中的蛋白質(zhì)含量，負(fù)載率公式如下：

式中，A表示蛋白負(fù)載率（%），m1表示材料中蛋白質(zhì)質(zhì)量，m2表示總材料質(zhì)量.

1.3.3 GO x＠ZPF中蛋白活性檢測(cè)

1.3.3.1 GO x＠ZPF中GO x催化產(chǎn)生葡萄糖酸檢測(cè)

GO x催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸可導(dǎo)致反應(yīng)體系pH降低.使用pH計(jì)監(jiān)測(cè)不同樣品反應(yīng)30 min后的pH變化，以及不同質(zhì)量濃度GO x＠ZPF（0，5，10，20，50和100μg·mL-1）反應(yīng)30 min后的pH變化.

1.3.3.2 GO x＠ZPF中GO x催化產(chǎn)生H2O2檢測(cè)

GO x催化葡萄糖反應(yīng)生成的H2O2，與HRP反應(yīng)產(chǎn)生·OH，可氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），并使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè).制備TMB+葡萄糖（Glucose），TMB+Glucose+GO x和TMB+Glucose+GO x＠ZPF不同的反應(yīng)體系，在pH=5.0和pH=7.0的反應(yīng)環(huán)境中，室溫孵育10 min，在652 nm處測(cè)定吸光度，用于證明GO x＠ZPF可催化葡萄糖產(chǎn)生H2O2.

改變葡萄糖物質(zhì)的量濃度（0，5，10，20和50 mmol·L-1），進(jìn)一步檢測(cè)GO x＠ZPF催化活性與底物濃度的關(guān)系.由于催化反應(yīng)迅速，降低反應(yīng)體系濃度，室溫孵育不同時(shí)間點(diǎn)（0，5，10，15，20，25，30，35和40 min），在特定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度，檢測(cè)GO x＠ZPF催化葡萄糖產(chǎn)生H2O2與時(shí)間的關(guān)系.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

4T1細(xì)胞在含10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS、100 units·mL-1青霉素、100 units·mL-1鏈霉素和2 mmol·L-1L-谷氨酰胺（L-glutamine）的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境采用37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2.

1.5 GO x＠ZPF的細(xì)胞攝取

1.5.1 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞攝取情況

在直徑35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中接種2.5×1044T1細(xì)胞用于共聚焦成像.細(xì)胞鋪板過夜后，將NHS-488標(biāo)記的GO x＠ZPF（0，2.5，5.0，10.0和25.0μg·mL-1）和細(xì)胞在1640（-Glucose）培養(yǎng)條件下孵育24 h后，PBS洗3次，4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛固定，采用共聚焦顯微鏡成像，并用數(shù)據(jù)處理軟件Image J對(duì)其進(jìn)行定量分析.

1.5.2 GO x＠ZPF與溶酶體共定位情況

在直徑35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中接種2.5×1044T1細(xì)胞用于共聚焦成像.細(xì)胞鋪板過夜后，細(xì)胞與NHS-488標(biāo)記的GO x＠ZPF（10μg·mL-1）孵育24 h后，采用lysotrack green（染料與培養(yǎng)基按1∶1 500的體積比稀釋）對(duì)溶酶體進(jìn)行活細(xì)胞熒光標(biāo)記，通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)GO x＠ZPF與溶酶體進(jìn)行共定位熒光成像，分析GO x＠ZPF與溶酶體的共定位情況.

1.6 細(xì)胞毒性檢測(cè)

1.6.1 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測(cè)

通過氧化DCFH-DA發(fā)出綠色熒光來評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS的生成.在直徑35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中接種2.5×1044T1細(xì)胞用于共聚焦成像.細(xì)胞接種過夜，細(xì)胞與GO x＠ZPF（5μg·mL-1）孵育6 h后，PBS洗2次，分別加入1640（+Glucose）和1640（-Glucose）設(shè)置不同實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)孵育2 h，到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，使用無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA探針（1∶5 000）與細(xì)胞孵育，通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行熒光成像，分析不同實(shí)驗(yàn)組催化反應(yīng)產(chǎn)生ROS的情況.

1.6.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用標(biāo)準(zhǔn)MTT法測(cè)定納米反應(yīng)器對(duì)4T1細(xì)胞活力的影響.在96孔板（每孔5×103個(gè)細(xì)胞）中鋪板接種細(xì)胞過夜，用不同濃度的GO x＠ZPF在1640（-Glucose）孵育6 h.到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，將培養(yǎng)基換成1640（+Glucose）繼續(xù)孵育6 h.然后，PBS洗滌3次，加入MTT溶液（100μL，0.5 mg·mL-1），靜置4 h，再用二甲基亞砜（DMSO）溶液（100μL）替代孵育20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

X=（Y實(shí)驗(yàn)組-Y空白組）/（Y對(duì)照組-Y空白組）×100%.

式中，X表示細(xì)胞存活率（%），Y表示吸光度值.

2 結(jié)果與討論

2.1 GO x＠ZPF的合成及表征

首先，采用水相合成的方法，制備GO x＠ZPF.通過TEM和場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）觀察GO x＠ZPF的形貌，如圖1（a）和圖1（b）所示，合成的GO x＠ZPF為多面體結(jié)構(gòu)，有良好的穩(wěn)定性，尺寸約為230 nm，可以降低其進(jìn)入細(xì)胞的阻力，有利于細(xì)胞攝取.動(dòng)態(tài)光散射分析儀（DLS）測(cè)量納米反應(yīng)器粒徑，如圖1（c）所示，該反應(yīng)器在6 d時(shí)間內(nèi)，穩(wěn)定性和分散性（PDI為材料的分散性指數(shù)）依舊良好，證明GO x＠ZPF是一種穩(wěn)定的載體材料.通過測(cè)量GO x溶液與GO x＠ZPF溶液的Zeta電位，如圖1（d）所示，2種樣品電位分別為-7.58 mV和-8.94 mV，證明反應(yīng)器成功負(fù)載GO x蛋白.用考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測(cè)法測(cè)量并計(jì)算得出反應(yīng)器中GO x蛋白負(fù)載率為35.7%，與其他載體相比，具有較高的蛋白負(fù)載效率［21-23］.綜上所述，合成的納米反應(yīng)器是一種理想的生物大分子載體.

圖1 GO x＠ZPF的合成及表征.（a）GO x＠ZPF的TEM圖；（b）GO x＠ZPF的SEM圖；（c）不同時(shí)間點(diǎn)GO x＠ZPF的水合粒徑；（d）GO x與GO x＠ZPF的Zeta電位

2.2 GO x＠ZPF的催化活性評(píng)估

對(duì)GO x＠ZPF的催化性能進(jìn)行評(píng)估，GO x＠ZPF納米反應(yīng)器氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2的反應(yīng)過程，如圖2（a）所示.反應(yīng)生成的葡萄糖酸會(huì)降低反應(yīng)體的pH，如圖2（b）和圖2（c）所示，純GO x溶液組反應(yīng)后，pH由6.69降低到3.85，GO x＠ZPF溶液組pH由6.69降低到4.46；隨著GO x＠ZPF質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)體系的pH值隨之下降，證明葡萄糖酸的生成量與GO x＠ZPF的用量呈濃度依賴性關(guān)系.

H2O2在HRP的存在下，可以將TMB氧化成氧化TMB（oxTMB），常用于檢驗(yàn)H2O2.如圖2（d）所示，在pH為5.0和7.0的反應(yīng)環(huán)境中，GO x與GO x＠ZPF均可發(fā)揮催化作用，產(chǎn)生H2O2.結(jié)果表明：GO x＠ZPF中蛋白活性良好，并且在pH為5.0的反應(yīng)條件下活性高（插圖為不同實(shí)驗(yàn)組下反應(yīng)后，混合液的顏色變化）.反應(yīng)生成H2O2的產(chǎn)量可以加深TMB的氧化程度，如圖2（e）所示，H2O2的產(chǎn)率與葡萄糖物質(zhì)的量濃度呈依賴性關(guān)系（插圖為反應(yīng)后的顏色變化圖）.圖2（f）證明，在同一底物濃度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，H2O2產(chǎn)量也隨之增加.由此可知，GO x＠ZPF中負(fù)載的GO x對(duì)葡萄糖保持著良好的催化活性，證明GO x＠ZPF是一種高效的納米載體.

圖2 GO x＠ZPF的催化活性評(píng)估.（a）GO x＠ZPF催化反應(yīng)過程示意圖；（b）不同樣品的氧化反應(yīng)pH值的變化；（c）不同質(zhì)量濃度的GO x＠ZPF與葡萄糖的氧化反應(yīng)pH值的變化；（d）在不同pH緩沖液中，不同樣品的催化反應(yīng)TMB氧化的吸收光譜和目視顏色變化；（e）在pH=5.0緩沖液中，不同葡萄糖物質(zhì)的量濃度的催化反應(yīng)TMB氧化的吸收光譜和目視顏色變化；（f）在pH=5.0緩沖液中，不同時(shí)間的催化反應(yīng)TMB氧化的吸收光譜

2.3 GO x＠ZPF的細(xì)胞攝取情況

本工作致力于構(gòu)建一種高效、安全的納米反應(yīng)器，可以運(yùn)輸?shù)鞍走M(jìn)入細(xì)胞，并發(fā)揮催化作用.因此，系統(tǒng)考察了納米反應(yīng)器與細(xì)胞相互作用情況.在無糖培養(yǎng)環(huán)境下，4T1細(xì)胞與反應(yīng)器共同孵育24 h后，通過激光共聚焦顯微成像分析細(xì)胞，如圖3（a）和3（b）所示，GO x＠ZPF反應(yīng)器可自主進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并且細(xì)胞的攝取量隨反應(yīng)器濃度的增加而增多.隨后，考察了納米反應(yīng)器在亞細(xì)胞水平的分布情況，采用lysotrack green對(duì)溶酶體進(jìn)行染色，如圖3（c）和圖3（d）所示，在共聚焦圖片中觀察到發(fā)出紅色熒光的GO x＠ZPF-（NHS-488）和發(fā)出綠色的熒光溶酶體發(fā)生了重疊形成黃色區(qū)域，這證明GO x＠ZPF進(jìn)入細(xì)胞后，被運(yùn)輸至溶酶體處發(fā)揮作用.

圖3 GO x＠ZPF的細(xì)胞攝取.（a）采用共聚焦顯微鏡對(duì)GO x＠ZPF-（NHS-488）（紅色）與細(xì)胞核（藍(lán)色）進(jìn)行雙色成像，比較不同質(zhì)量濃度的GO x＠ZPF與4T1細(xì)胞孵育24 h后，細(xì)胞攝取差異情況；（b）定量分析不同質(zhì)量濃度GO x＠ZPF的細(xì)胞攝取差異；（c）采用共聚焦顯微鏡對(duì)GO x＠ZPF-（NHS-488）（紅色）與溶酶體（綠色）進(jìn)行雙色成像，并進(jìn)行共定位研究，與4T1細(xì)胞孵育24 h時(shí)間（圖片標(biāo)尺前三張10μm，放大圖25μm）；（d）定量分析GO x＠ZPF與溶酶體的共定位情況

2.4 GO x＠ZPF對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響

體外實(shí)驗(yàn)證明，GO x＠ZPF可以氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O2.那么，如果GO x＠ZPF進(jìn)入細(xì)胞后，必然會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖，產(chǎn)生大量的H2O2.為了驗(yàn)證這個(gè)推論，研究可被H2O2氧化發(fā)綠色熒光的DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平.如圖4（a）所示，在無葡萄糖培養(yǎng)下，GO x＠ZPF可消耗細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)生微量的綠色熒光；當(dāng)?shù)孜镉衅咸烟谴嬖跁r(shí)，GO x＠ZPF可消耗供給的葡萄糖產(chǎn)生大量H2O2，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào).圖4（b）是細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析圖，證明GO x＠ZPF可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮催化作用，生成H2O2.

一般來說，腫瘤細(xì)胞對(duì)H2O2更加敏感，較高濃度H2O2可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長.因此，進(jìn)一步檢測(cè)了GO x＠ZPF在無糖條件下攝取后，有糖條件下繼續(xù)孵育后的細(xì)胞活力.如圖4（c）的結(jié)果分析，當(dāng)GO x＠ZPF質(zhì)量濃度為3μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力為51.9%，當(dāng)質(zhì)量濃度到達(dá)5μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力降低至34%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：GO x＠ZPF在細(xì)胞內(nèi)可以發(fā)揮較大的催化活性，對(duì)癌細(xì)胞活力有較強(qiáng)的抑制作用.

圖4 GO x＠ZPF的細(xì)胞毒性評(píng)估.（a）采用共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞內(nèi)ROS生成；（b）定量分析細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量差異；（c）不同質(zhì)量濃度GO x＠ZPF對(duì)細(xì)胞活力的影響

3 結(jié)論

構(gòu)建了水相合成的納米反應(yīng)器GO x＠ZPF，合成過程簡單，顆粒的穩(wěn)定性和分散性良好；在保持GO x酶催化活性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高效載帶.同時(shí)，GO x＠ZPF可以載帶GO x進(jìn)癌細(xì)胞，積聚在溶酶體處，通過消耗細(xì)胞質(zhì)中的葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和大量的H2O2，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡.研究工作不僅為蛋白質(zhì)活性保護(hù)及細(xì)胞運(yùn)輸提供一種理想載體，也為腫瘤治療提供了具有潛力的新方法.