馬寶珠，劉世軍△，李 慧，劉 永

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng)712083；2陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心；3秦藥特色資源研究開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）；4陜西省創(chuàng)新藥物研究中心

大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實(shí)［1］，具有“補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神”的功效［2］。大棗作為藥食同源的食品，被人們廣泛使用。研究表明，大棗中含有三萜酸類、黃酮類、環(huán)核苷酸類、多酚類、多糖、低聚糖等多種成分［3-5］，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、防治心血管疾病、提高免疫力等作用［6］。

目前，我國(guó)大棗產(chǎn)量雖高，但對(duì)大棗多樣化產(chǎn)品的開發(fā)程度不夠。大棗含糖量約50%～80%，其中一些糖分對(duì)人們有益，而另外一些糖分則不太受到人們的歡迎，如葡萄糖和果糖［7-8］。本實(shí)驗(yàn)利用不同的膜，依據(jù)“篩分”效應(yīng)來試驗(yàn)大分子與小分子之間的分離，對(duì)大棗水提液中不同的糖進(jìn)行分離。依據(jù)分離效果，找出最適合的膜。

1 材料

1.1 儀器LNG-HFM-101型中空纖維膜分離設(shè)備（膜型號(hào)LNG-HFM U6，LNG-HFM U0.2，上海郎級(jí)膜分離設(shè)備工程有限公司）；LNG-HFM-101型中空陶瓷膜分離設(shè)備（膜型號(hào)LNG-CM 0.2 μm，LNG-CM0.05 μm，上海郎級(jí)膜分離設(shè)備工程有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；電子分析天平（賽多利斯科科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑葡萄糖（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；3，5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid）（化學(xué)純，上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；硫酸（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；無水乙醇（分析純，安徽安特食品股份有限公司）；亞硫酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉（均為分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備將大棗洗凈去核干燥處理，用12倍水煎煮3次，每次2 h，提取液過濾，濃縮為浸膏，冷藏備用。取80 mL浸膏加純化水稀釋至2000 mL，即為原樣品溶液，生藥含量約為0.1 g/mL。

2.2 樣品的過膜經(jīng)考察確定，過膜時(shí)陶瓷膜和中空纖維膜壓力各為0.5 MPa，溫度為30℃。將2000 mL的原樣品溶液分別過0.2、0.05 μm的微濾陶瓷膜，剩余截留液為100 mL時(shí)停止過濾，所得截留液分別為Ⅰ號(hào)樣品和Ⅱ號(hào)樣品。將2000 mL的原樣品溶液分別過U6的超濾纖維膜和U0.2的微濾纖維膜，剩余截留液為100 mL時(shí)停止過濾，所得截留液分別為Ⅲ號(hào)樣品和Ⅳ號(hào)樣品。

2.3 總糖含量測(cè)定方法［9］總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密抽取0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中，加純化水至2 mL，然后加入6%苯酚溶液（由80%苯酚現(xiàn)配）1.0 mL，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL后，常溫放置30 min，再冰水浴5 min，于490 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值?？瞻讓?duì)照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖則以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制，見圖1?；貧w方程：y=17.674x-0.0556；相關(guān)系數(shù)：R2=0.9972。見圖1。

圖1 總糖測(cè)定中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 還原糖含量的測(cè)定方法[10-12]

2.4.1 DNS試劑的配置A液：稱取6.3 gDNS，21.0 g氫氧化鈉充分溶解于400 mL加熱脫氣后的純化水中。B液：稱取182.0 g酒石酸鉀鈉溶解于400 mL脫氣后的溫水中，再加入5.0 g苯酚，5.0 g亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，并放置至常溫。最后將A液與B液混合均勻，倒入1000 mL的棕色容量瓶中并定容至刻度線，即為配制好的DNS試劑。將DNS試劑冷藏于冰箱中備用，至少放置7天后使用。

2.4.2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取1.00 mg/mL的葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于25 mL容量瓶中，加純化水至2 mL，再移取5.0 mLDNS試劑加入容量瓶中。搖勻，沸水浴5 min后，立即置于冰水中20 min，最后定容至刻度線，于493 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度?？瞻讓?duì)照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖則以橫坐標(biāo)為濃度，縱坐標(biāo)為吸光度進(jìn)行繪制，見圖2?；貧w方程：y=32.113x-0.0853；相關(guān)系數(shù)：R2=0.9989。見圖2。

圖2 還原糖測(cè)定中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.3 條件優(yōu)化

2.4.3.1 顯色條件 通過閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法測(cè)總糖的方法比較穩(wěn)定，而DNS法測(cè)還原糖時(shí)，顯色條件有較大的不同。因此，針對(duì)還原糖的測(cè)定進(jìn)行顯色條件優(yōu)化。

2.4.3.2 最大吸收波長(zhǎng) 精密移取1.00 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL于25 mL容量瓶中，加純化水至2 mL。搖勻后加入5.00 mLDNS試劑，沸水浴3 min后，立即放入冰水中冷卻20 min，最后定容至刻度線，于450～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，測(cè)其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖溶液作空白對(duì)照。見圖3。由圖可知，波長(zhǎng)為493 nm時(shí)有最大吸光度，故本實(shí)驗(yàn)還原糖測(cè)定時(shí)選用的波長(zhǎng)為493 nm。

圖3 光譜掃描圖

2.4.3.3 顯色劑用量 在6只25 mL容量瓶中，分別加入1 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL，并補(bǔ)純化水至2 mL。在分別依次加入2、3、4、5、6、7 mL的DNS溶液，搖勻后立即沸水浴3 min。取出，冰水浴20 min，再加純化水定容至刻度線，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對(duì)照。結(jié)果見圖4。由圖4可知，DNS用量為4～7 mL時(shí)，吸光度趨于穩(wěn)定，DNS用量為5 mL時(shí)，吸光度最大，故選擇加入顯色劑的用量為5 mL。

圖4 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響

2.4.3.4 顯色反應(yīng)時(shí)間 分別加入1 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL于5只25 mL容量瓶中，并補(bǔ)純化水至2 mL。再各加入5 mL的DNS溶液，搖勻后分別沸水浴3、4、5、6、7 min顯色，取出，冰水浴20 min，再加純化水定容，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對(duì)照。見圖5。由圖可知，顯色反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí)測(cè)定的吸光度最大，故選擇顯色反應(yīng)時(shí)間為5 min。

圖5 顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密移取0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶，按照還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定吸光度值，測(cè)得吸光度分別為0.567、0.559、0.572、0.565、0.563、0.577，RSD=1.14%。結(jié)果表明，吸光度無明顯變化，說明方法精密度良好。

2.4.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密移取0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶，按照還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法每隔5 min測(cè)一次吸光度，連續(xù)30 min考察穩(wěn)定性。測(cè)得吸光度分別為0.560、0.576、0.564、0.576、0.559、0.561，RSD=1.40%。結(jié)果表明，吸光度值30 min內(nèi)無明顯變化，說明方法穩(wěn)定性良好。

2.4.4.3 還原糖加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密移取已知還原糖（大棗粉末還原糖）含量為0.513 8 mg/mL的樣品溶液0.5 mL，按還原糖含量的80%、100%、120%，加入對(duì)應(yīng)葡萄糖濃度的溶液0.5 mL，按照“2.4.2”還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，還原糖平均加樣回收率為101.00%，RSD為4.48%。符合要求。見表1。

表1 還原糖加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.5樣品中總糖和還原糖的測(cè)定將樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)分別加純化水稀釋至合適的倍數(shù)，搖勻，即得樣品溶液。測(cè)定前，將樣品溶液搖勻，精密移取2 mL于具塞試管中，加入6%的苯酚溶液1 mL，搖勻后立即加入濃硫酸5 mL。常溫放置30 min后冰水浴5 min，于490 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值?？瞻讓?duì)照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。最后根據(jù)“2.3”項(xiàng)所得的總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求得樣品溶液中總糖濃度。見表2。

表2 樣品過不同膜后含糖量測(cè)定

將樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)分別加純化水稀釋至合適的倍數(shù)，搖勻，即得樣品溶液。取1 mL樣品溶液并加純化水1 mL于25 mL容量瓶中。加入5 mL的DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min顯色，然后冰水浴20 min后，加純化水定容至刻度線，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。以2 mL純化水代替樣品溶液作空白對(duì)照。最后根據(jù)“2.4.2”項(xiàng)中還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求得樣品溶液中還原糖濃度。見表2。

大棗中的糖分為單糖、低聚糖和多糖，由于多糖和低聚糖的含量無法直接測(cè)定，因此以總糖和單糖（還原糖）之差來反映低聚糖和多糖的含量。見表2。

由表2可知，在壓力為5 MPa，溫度為30℃的情況下，通過比較0.2 μm和0.05 μm微濾陶瓷膜、U6和U0.2超濾纖維膜這4種膜。4種不同膜對(duì)大棗單糖（還原糖）的透過效果依次為：U6超濾纖維膜＞U0.2微濾纖維膜＞0.05 μm微濾陶瓷膜＞0.2 μm微濾陶瓷膜。4種不同膜對(duì)大棗多糖及低聚糖的截留效果依次為：U6超濾纖維膜＞U0.2微濾纖維膜＞0.2 μm微濾陶瓷膜＞0.05 μm微濾陶瓷膜。因此U6超濾纖維膜對(duì)大棗的過膜效果相對(duì)最好，過膜速度也較快。

3 討論

本研究利用膜分離技術(shù)對(duì)大棗水提液的截留效果進(jìn)行初步考察。結(jié)果表明，膜分離技術(shù)對(duì)大棗多糖和低聚糖有一定的截留效果，同時(shí)截留液中還原糖含量也有所降低。但就膜而言，過膜效率低，過膜時(shí)間久，膜的清洗也需花費(fèi)大量時(shí)間；就大棗而言，大棗中含糖量高，同時(shí)糖類成分復(fù)雜、差異大。過膜要將其完全分開存在一定困難。因此，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)中對(duì)大棗水提液含糖量的實(shí)際需要選擇0.2、0.05 μm的微濾陶瓷膜或U6、U0.2的微濾纖維膜。