烏恩吉雅 杜冬華,2 馬雪妮 哈斯蘇榮,3*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，張家口 075131；3.內(nèi)蒙古駱駝研究院，阿拉善 750300)

熱應(yīng)激(heat stress, HS)是熱帶地區(qū)及高溫季節(jié)最嚴(yán)重的應(yīng)激源之一，現(xiàn)已成為危害全世界動(dòng)物生產(chǎn)的重要因素，亦對(duì)動(dòng)物福利造成了重大影響[1]。持續(xù)暴露于高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物各種應(yīng)激反應(yīng)，如體核溫度升高、采食量減少、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和代謝改變等，進(jìn)而增加對(duì)各種疾病的易感性[2]。當(dāng)HS引起的體溫升高和代謝過(guò)度時(shí)，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生就會(huì)增加，進(jìn)而激活炎癥信號(hào)通路并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的分泌和激活凋亡[3]。此外，肝臟損傷是HS病例中最致命的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患病動(dòng)物死亡的直接原因[4]。因此，抑制炎癥反應(yīng)對(duì)于預(yù)防HS所致肝臟損傷并保護(hù)機(jī)體健康至關(guān)重要。

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)家族成員是天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)之間的主要聯(lián)系，其中Toll樣受體4(TLR4)可通過(guò)識(shí)別外源性或內(nèi)源性配體介導(dǎo)免疫細(xì)胞活化、炎癥細(xì)胞因子釋放和組織損傷所需的主要受體[5]。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)屬于HMG家族成員，是一種非組蛋白結(jié)合蛋白，在介導(dǎo)晚期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。在生理?xiàng)l件下，HMGB1位于細(xì)胞核與DNA結(jié)合，以穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯。然而，在病理?xiàng)l件下，如發(fā)生肝臟損傷、細(xì)胞損傷及壞死時(shí)，可誘導(dǎo)HMGB1從細(xì)胞核移位到細(xì)胞外間隙激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放和白細(xì)胞募集維持炎癥微環(huán)境，最終引起組織損傷[6-9]。最近，Geng等[4]進(jìn)一步證實(shí)HMGB1是TLR4的上游信號(hào)分子，腹腔注射HMGB1抗體可通過(guò)TLR4信號(hào)通路抑制HS誘導(dǎo)的大鼠肝臟炎癥反應(yīng)，從而緩解肝臟損傷。因此，靶向HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能是預(yù)防HS所致肝臟炎癥的有效途徑。

駱駝乳清蛋白(camel whey protein, CWP)由α-乳白蛋白(α-LA)、乳鐵蛋白(LF)、血清白蛋白(SA)、乳過(guò)氧化物酶(LPO)等組成，但缺乏易引起幼齡動(dòng)物過(guò)敏反應(yīng)的β-乳球蛋白(β-LG)[10]。據(jù)報(bào)道，駱駝乳清蛋白3(CWP3)可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子分泌來(lái)促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚傷口的愈合，且其治療效果優(yōu)于牛乳[11-12]。膳食補(bǔ)充CWP亦可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而抑制HS小鼠淋巴細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子[2]。本課題組前期在體外試驗(yàn)中也證實(shí)，經(jīng)過(guò)模擬胃腸消化的CWP可通緩解氧化應(yīng)激而抑制NF-κB信號(hào)通路，降低HS誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)、凋亡和損傷[13]。上述研究提示，CWP在調(diào)節(jié)HS誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)方面具有潛在的獨(dú)特作用。然而，迄今為止，CWP在動(dòng)物模型中對(duì)HS所致肝臟炎癥作用及機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用亦有待探索。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，探討了CWP對(duì)HS所致大鼠肝臟炎癥的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討了CWP對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

CWP由本實(shí)驗(yàn)室按先前報(bào)道的方法制備并保存[13]；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廈門侖昌碩生物科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗HMGB1抗體(貨號(hào)：ab18256)、兔抗TLR4抗體(貨號(hào)：ab217274)、兔抗β-actin抗體(貨號(hào)：ab8227)購(gòu)于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；兔抗磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB p65 (p-NF-κB p65)抗體(貨號(hào)：3033)購(gòu)于Cell Signaling Technology (CST)公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗購(gòu)于天津三箭生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液(pH 8.0)、3，3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；底物化學(xué)發(fā)光(ECL)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于蘇州宇恒生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑、蛋白定量用Pierce BCA Protein Assay Kit購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；大鼠維持飼料購(gòu)于某生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后隨機(jī)分為6組：HS致肝臟損傷組(HS組)、CWP低劑量干預(yù)組(L組)、CWP中劑量干預(yù)組(M組)、CWP高劑量干預(yù)組(H組)、正常對(duì)照組(Control組)和CWP對(duì)照組(CWP組)。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只，試驗(yàn)期22 d。L、M和H組大鼠每天灌服CWP(CWP溶于1 mL生理鹽水，劑量分別為100、200和400 mg/kg BW)，Control和HS組每天灌服1 mL生理鹽水，CWP組每天灌服400 mg/kg BW的CWP，連續(xù)2周；之后，按本實(shí)驗(yàn)室先前建立的方法進(jìn)行HS處理：除Control和CWP組外，其他各組大鼠于人工氣候箱[溫度為(40.0±0.2) ℃，相對(duì)濕度為60%～65%]內(nèi)進(jìn)行HS處理2 h(10:00—12:00)，連續(xù)處理8 d。每次HS處理結(jié)束后，立即將大鼠移出人工氣候箱并于初始環(huán)境飼養(yǎng)24 h。HS處理期間，于每次HS前1 h灌服上述劑量CWP或生理鹽水。

1.3 免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)HS大鼠肝臟HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

取大鼠肝臟組織，用Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按常規(guī)方法進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜用QuickBlockTMWestern封閉液室溫封閉1 h后于稀釋的HMGB1(1∶2 000)、TLR4(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(1∶10 000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜。蛋白表達(dá)水平通過(guò)Quantity One ChemiDocXRS圖像采集系統(tǒng)及Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65光密度值/β-actin光密度值表示。剩余大鼠肝臟組織分為2部分，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分于液氮冷凍后置-80 ℃保存，備用。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HS大鼠肝臟HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

4%多聚甲醛固定后的組織塊經(jīng)石蠟包埋并制成4 μm切片，每只大鼠制備3張連續(xù)切片，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)定位。每張切片于400×顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，結(jié)果分析采用積分綜合計(jì)量法。利用Image J軟件的IHC Profiler插件對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行自動(dòng)評(píng)分：0(陰性)、1(弱陽(yáng)性)、2(中度陽(yáng)性)和3(強(qiáng)陽(yáng)性)。此外，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分：0(<5%)、1(5%～25%)、2(25%～50%)、3(50%～75%)和4(>75%)。然后，按文獻(xiàn)[14]描述方法計(jì)算，免疫組化評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比分值×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。

1.5 ELISA檢測(cè)HS大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子含量

取1.3中凍存的大鼠肝臟組織，按試劑盒說(shuō)明說(shuō)操作檢測(cè)大鼠肝臟組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 25.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法進(jìn)行組間比較，結(jié)果以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Western blotting法分析CWP干預(yù)對(duì)HS大鼠肝臟HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

如圖1所示，HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與了HS所致大鼠肝臟損傷過(guò)程中的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控。結(jié)果表明，HS大鼠肝臟中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平極其顯著上調(diào)(P<0.001)，相比于Control組分別上調(diào)了8.50和10.17倍，但HMGB1蛋白表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。CWP(200、400 mg/kg)可極顯著和極其顯著抑制p-NF-κB p65(P<0.01)和TLR4(P<0.001)蛋白表達(dá)水平。然而，100、200、400 mg/kg CWP同樣沒(méi)有顯著影響HMGB1蛋白表達(dá)水平(P>0.05)。

2.2 免疫組織化學(xué)法分析CWP干預(yù)對(duì)HS大鼠肝臟HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，免疫組化結(jié)果與2.1描述一致，不同的是，雖然HS對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P>0.05)，但可使肝細(xì)胞核中HMGB1蛋白表達(dá)水平降低(圖2-A，如紅色箭頭所示)，胞漿中表達(dá)水平升高(圖2-A，如黑色箭頭所示)。有趣的是，雖然CWP對(duì)HMGB1蛋白免疫組化評(píng)分亦無(wú)顯著影響(P>0.05，圖2-B)，但CWP可逆轉(zhuǎn)HMGB1蛋白的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，且400 mg/kg CWP幾乎完全恢復(fù)了HMGB1蛋白的細(xì)胞核定位(圖2-A)。CWP(400 mg/kg)可極顯著抑制TLR4蛋白表達(dá)(P<0.01，圖2-C和圖2-D)。此外，免疫組化評(píng)分結(jié)果顯示，400 mg/kg CWP亦極其顯著地恢復(fù)了p-NF-κB p65蛋白的胞漿表達(dá)(P<0.001)，表明CWP可抑制其核轉(zhuǎn)位(圖2-D和圖2-E，如綠色箭頭所示)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，CWP對(duì)HS大鼠肝臟HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路具有調(diào)控作用，綜合分析，400 mg/kg劑量效果較好。

2.3 CWP干預(yù)對(duì)HS大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子含量的影響

炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)HS所致肝臟損傷的主要因素之一。因此，本研究采用ELISA方法檢測(cè)了各組大鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10含量，以確定HS前灌服CWP是否可抑制肝臟損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)。由表1可見(jiàn)，HS組大鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量均顯著升高(P<0.05)，而IL-10含量顯著降低(P<0.05)。HS前灌服400 mg/kg CWP可顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量(P<0.05)，顯著提高IL-10含量(P<0.05)。此外，CWP表現(xiàn)出使正常大鼠肝臟中上述細(xì)胞因子含量升高趨勢(shì)，但與Control組相比差異不顯著(P>0.05)。

HMGB1：高遷移率族蛋白B1 hepatic high mobility group protein B1； TLR4 ：Toll樣受體4 Toll like receptor; 4p-NF-κB p65: 磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB p65 phosphorylated nuclear factor-κB;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。Control: 正常對(duì)照組 control group; CWP: 駱駝乳清蛋白組 CWP group; HS: 熱應(yīng)激致肝臟損傷組 HS group; L: 駱駝乳清蛋白低劑量干預(yù)組 L group; M: 駱駝乳清蛋白中劑量干預(yù)組 M group; H: 駱駝乳清蛋白高劑量干預(yù)組 H group。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，***表示差異極其顯著(P<0.001) * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates highly significant difference (P<0.01), *** indicates extremely significant difference (P<0.001)。下圖同 the same as below.

3 討 論

HS已在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響了動(dòng)物健康和生產(chǎn)，其實(shí)質(zhì)是動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的熱量超過(guò)了其將熱量散發(fā)到周圍環(huán)境的能力。發(fā)生HS的動(dòng)物會(huì)傾向于通過(guò)減少采食量來(lái)減少產(chǎn)熱，由此對(duì)生長(zhǎng)性能產(chǎn)生負(fù)面影響[1,4,15]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，肝臟損傷是幾乎所有HS病例中最常見(jiàn)且致命的并發(fā)癥[16-18]。此外，盡管HS是由高溫引起的，但即使恢復(fù)HS動(dòng)物模型體溫也不能阻止炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使肝臟損傷在HS恢復(fù)過(guò)程中才逐漸顯現(xiàn)[19]。因此，HS所致肝臟損傷可能不是高溫作用的直接結(jié)果，而是由后期持續(xù)的炎癥反應(yīng)所介導(dǎo)的[19]。已有研究證實(shí)，CWP具有顯著的抗炎作用[11-12,20]，且其水解產(chǎn)物具有抗肝癌細(xì)胞(HepG2)炎癥反應(yīng)活性[21]，表明其具有抗HS致肝臟損傷潛能。另?yè)?jù)報(bào)道，糖尿病小鼠補(bǔ)充CWP可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子分泌來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)，從而加速皮膚傷口的愈合[11-12]。本課題組前期試驗(yàn)亦表明，CWP可通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路緩解HS所致大鼠肝臟細(xì)胞損傷及凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了CWP抗HS致肝臟損傷的潛在醫(yī)用價(jià)值，但其抗炎機(jī)制有待深入研究[13]。因此，本研究探討了CWP對(duì)HS大鼠肝臟炎癥的作用及可能機(jī)制。

圖A和圖B：用免疫組化法分析HMGB1蛋白表達(dá)；圖C和圖D：用免疫組化法分析TLR4蛋白表達(dá)；圖E和圖F：用免疫組化法分析p-NF-κB p65蛋白表達(dá)。黑色箭頭：目的蛋白在胞漿中表達(dá)增多；紅色箭頭：目的蛋白在胞核中表達(dá)降低；綠色箭頭：目的蛋白在胞核中表達(dá)升高。

最近的研究表明，在無(wú)菌性感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)中，HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)。在生理?xiàng)l件下，HMGB1位于細(xì)胞核并與DNA結(jié)合，以穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯。然而，在病理?xiàng)l件下，如肝細(xì)胞損傷及壞死時(shí)，可誘導(dǎo)HMGB1從細(xì)胞核移位到細(xì)胞外間隙激活NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌[6-7]。另一項(xiàng)研究亦證實(shí)，當(dāng)肝臟損傷發(fā)生時(shí)，HMGB1蛋白可被誘導(dǎo)表達(dá)并通過(guò)受損細(xì)胞被動(dòng)釋放至細(xì)胞外，或者從激活的免疫細(xì)胞中主動(dòng)分泌[9]。被釋放至胞外的HMGB1可通過(guò)TLR4激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子分泌，從而促進(jìn)炎癥發(fā)展[22]。因此，HMGB1/TLR4/NF-κB軸在介導(dǎo)各種應(yīng)激因素誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Yin等[23]研究顯示，通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路可改善炎癥所致小鼠肝臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，HS大鼠肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量均顯著升高，IL-10含量顯著降低。相應(yīng)地，HS大鼠肝臟中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，HMGB1胞外表達(dá)量亦明顯增多。這些數(shù)據(jù)提示，HS大鼠肝臟發(fā)生了炎癥反應(yīng)。有趣的是，HS前灌服CWP可以劑量依賴性方式逆轉(zhuǎn)TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的改變，伴隨著肝臟IL-1β、IL-6、IL-8含量的降低和IL-10含量的升高。這與Ramadan等[2]研究結(jié)果一致，膳食補(bǔ)充CWP可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而降低HS誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和IL-4含量。另外，Western blotting結(jié)果顯示CWP不影響HMGB1蛋白表達(dá)量，然而免疫組化結(jié)果顯示其抑制了HMGB1的核轉(zhuǎn)位，恢

復(fù)了其胞核內(nèi)蛋白表達(dá)量，這與Geng等[4]研究結(jié)果一致。因此，我們推測(cè)CWP可能并不是直接與HMGB1相互作用，而是通過(guò)修復(fù)損傷細(xì)胞降低了HMGB1的釋放，導(dǎo)致其不能通過(guò)TLR4激活NF-κB信號(hào)通路，最后抑制了細(xì)胞因子的分泌。因?yàn)橐延醒芯勘砻鳎珻WP可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子分泌來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)，從而加速糖尿病小鼠皮膚傷口愈合[11-12]。雖然該假說(shuō)尚需進(jìn)一步證實(shí)，但本研究仍可證實(shí)CWP對(duì)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，CWP可能是通過(guò)調(diào)節(jié)該途徑抑制了HS誘導(dǎo)的大鼠肝臟炎癥反應(yīng)。

表1 CWP干預(yù)對(duì)HS大鼠肝臟細(xì)胞因子含量的影響

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1在HS所致肝臟損傷中的作用，并闡明了HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路在HS誘導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)中的可能機(jī)制，提示HMGB1可能是干預(yù)HS所致肝臟損傷的潛在靶點(diǎn)。此外，本研究初步闡明了CWP對(duì)HS大鼠肝臟炎癥及HMGB1/TLR4/NF-κB途徑的調(diào)控作用。