梁嬋華，黃妍，莫敏敏,2，陳城宇,3，宋家樂,4*

（1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林 541199）（2.廉江市人民醫(yī)院營養(yǎng)科，廣東廉江 524400）（3.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，廣西南寧 530000）（4.桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣西桂林 541199）

作為人體內(nèi)重要的消化器官，腸道擁有龐大的腸道菌群并集結(jié)了人體70%～80%的免疫細胞。因此，腸道也被認為是人體內(nèi)最重要的內(nèi)分泌及免疫器官。正常狀態(tài)下腸道菌群之間相互依存并相互制約，時刻維持著彼此間的動態(tài)平衡狀態(tài)。腸道菌群失衡將導致腸道免疫系統(tǒng)失衡，使得機體免疫系統(tǒng)異常激活，從而導致腸道炎癥甚至是全身炎癥反應的發(fā)生[1-3]。研究提示，結(jié)直腸癌有較明確的“炎癥-癌癥”轉(zhuǎn)化病變，腸道系統(tǒng)慢性炎癥與癌癥風險的增加密切相關(guān)，嚴重危害人類健康[4]。臨床流行病數(shù)據(jù)顯示，炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者的結(jié)直腸癌發(fā)病率遠高于正常人群[5]。而在中國，2018年結(jié)直腸癌新發(fā)病例和死亡病例分別增至52.1萬例和24.5萬例，結(jié)直腸癌在全部惡性腫瘤發(fā)病率排名由第3位升至第2位[6]。因此，探索具有安全性和生物活性的抗炎物質(zhì)已成為結(jié)直腸腫瘤及相關(guān)疾病的防治研發(fā)熱點之一。

元寶楓籽油是從無患子目槭樹科槭屬落葉喬木元寶楓（Acer truncatumBunge）果實中提煉出來的純天然木本植物油，富含油酸、亞油酸、功能性脂肪酸-神經(jīng)酸及豐富的脂溶性維生素E[7]。此外，也有研究報道稱元寶楓籽油具有抗菌[8]及抗腫瘤作用[9]，能夠增強小鼠免疫力[10]，調(diào)節(jié)腸道菌群[11]，并能夠改善力竭運動大鼠氧化應激和體內(nèi)炎癥反應水平的功效[12]。此外，元寶楓油乳液能促進新生組織生長，對體細胞有修復作用[13]，目前，楓籽油已經(jīng)被國家衛(wèi)健委批準列為新資源食品。

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成。研究表明，在實驗動物腹腔內(nèi)暴露低劑量LPS可通過緊密連接選擇性地增加腸道通透性，誘發(fā)腸道出現(xiàn)炎癥反應，從而模擬急性腸道功能障礙[14]。因此，本研究采用腹腔注射LPS的方式來建立小鼠腸道炎癥模型。通過觀察元寶楓籽油對LPS腸道損傷小鼠體重，腸道炎癥水平及結(jié)腸組織病理的改善情況；評估對炎性指標物MPO酶活性及氧化應激損傷指標MDA的影響，觀察對NLRP3炎癥小體相關(guān)因子mRNA表達的影響。以此探究元寶楓籽油對腸道炎癥反應的改善效果并比較其效果是否與玉米油存在差異，為元寶楓籽油這種新資源食品將來應用于腸道炎癥患者的腸內(nèi)營養(yǎng)治療提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

元寶楓油（亞油酸≥30.0%，油酸≥15.0%，神經(jīng)酸≥5.0%）由西安拓豐生物科技有限公司提供（生產(chǎn)年份：2020年3月）；玉米胚芽油（不飽和脂肪酸含量為≥80.0%，亞油酸≥40.0%）由山東西王食品有限公司提供（生產(chǎn)年份：2019年12月）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L8880）、Trizol法總RNA提取試劑盒（R1200-50T）、TaqMan快速qRT-PCR試劑盒（T2210-200T）：北京索萊寶生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（H&E）染色試劑盒（C0105）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白細胞介素（interleukin, IL）-1β，IL-6，IL-18，腫瘤壞死因子-α（TNF-α），髓過氧化 物 酶（myeloperoxidase，MPO）及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒，均購于江蘇科特生物技術(shù)有限公司；普通嚙齒類維持飼料（AIN-93M），購自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；Eppendorf 5424R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Quant StudioTM 6 Flex PCR儀，美國Thermo Scientific科技公司；KZ-II高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司；ELx808酶標儀，美國BioTek公司；Leica DM4B顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司；L-600離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級健康ICR雄性小鼠（總28只，12周齡，體重34.4±1.1 g），由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002；所有動物均置于桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)，實驗單位許可證號：SYXK（桂）2020-0005。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學院實驗動物倫理委員會審查通過（GLMC201803049）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組與給藥處理

所有經(jīng)小鼠1周適應性喂養(yǎng)后，以每組7只隨機分為正常組，損傷組，玉米油組，元寶楓籽油組行后續(xù)實驗。小鼠腸道損傷模型依趙曉等[15]的方法進行操作，損傷組，玉米油組，元寶楓籽油組小鼠經(jīng)腹腔注射LPS（3.5 mg/kg）造模，正常組注射等量生理鹽水。注射24 h后，分別測量各組小鼠空腹體重，正常組和損傷組灌胃生理鹽水（100 μL/d），元寶楓籽油組和玉米油組分別灌胃等量油樣至第7天。整個實驗期間以普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，自由攝食與飲水。

1.4.2 實驗動物體重測量、生物樣本的收集與處理

在整個實驗期間內(nèi)（共7 d），每日于固定時間點測量小鼠體量、攝食與飲水情況并記錄。待7 d干預結(jié)束后，各組小鼠12 h禁食（自由飲水），以CO2安樂死法犧牲小鼠。自腹部中央動脈采集血樣，以3500 r/min在4 ℃條件下離心15 min后制備血清后留存-80 ℃冰箱備用。取血后，置實驗動物于冰上，快速分離其心臟、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸及結(jié)腸組織，用冰生理鹽水洗去表面雜質(zhì)，濾紙吸干，計算臟器指數(shù)[(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%]。測量結(jié)腸長度后，取部分用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，700 r/min條件下離心15 min制備上清液留存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)指標的檢測。剩余結(jié)腸組織部分用4%多聚甲醛固定待進行病理分析，余下組織則保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)qPCR分析。

1.4.3 血清及結(jié)腸組織中相關(guān)炎癥因子水平測定

嚴格依照ELISA檢測試劑盒的相關(guān)說明操作，分別檢測血清和結(jié)腸組織勻漿液中的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平（單位：ng/L），及結(jié)腸組織中的MPO水平（單位：ng/L）與MDA水平（單位：μmol/g protein）。

1.4.4 結(jié)腸組織標本處理及病理染色觀察

將1.4.2部分中所述經(jīng)固定后的結(jié)腸組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片后（5 μm），進行H&E染色，用徠卡DM4B光學顯微鏡觀察組織病理學改變，并拍攝圖像記錄。

1.4.5 qRT-PCR法測定腸黏膜組織中NLRP3炎性小體相關(guān)因子mRNA的表達

以細胞刮刀收集適量結(jié)腸組織（200 mg）的黏膜并按試劑盒要求提取黏膜中總RNA并檢測其純度。依qPCR試劑盒要求充分混勻各組分，即在總反應體系中加入2 μg的RNA樣品，25×qRT-PCR預混液（1 μL），5×qRT-PCR緩沖液（5 μL），目的引物混合物（10 μmol/L，2 μL），TaqMan探針（0.2 μmol/L）并補ddH2O至總體積25 μL后置于QuantStudioTM6 Flex PCR儀中擴增。擴增反應條件為反轉(zhuǎn)錄（50 ℃，20 min），變性（95 ℃，3 min），退火（56 ℃，20 s），延伸（72 ℃，30 s）實施30～35個循環(huán)反應。每個基因cDNA樣本平行擴增3次，取Ct值均數(shù)，依據(jù)以下公式計算目的基因表達水平。

本研究中Nlrp3、Asc、Il1β、Caspase1引物序列依據(jù)課題組先前研究[16]并由Thermo Scientific公司負責合成。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，實驗結(jié)果均以均數(shù)加減標準差表示，且所有實驗均重復3次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理使用單因素方差分析（ANOVA）并進行多組之間均數(shù)的差異性檢驗，p<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠體重的影響

如圖1所示，實驗開始前各組小鼠體重均無顯著性差異（p>0.05）。相比于正常組小鼠體重而言，LPS腹腔注射處理能顯著造成小鼠體重下降（p<0.05）。造模后小鼠分別進行灌胃干預，結(jié)果顯示，各組小鼠體重均呈升高趨勢。相較初始體重，正常組小鼠體重增長了4.76%。觀察其他另外三組小鼠體重發(fā)現(xiàn)，相較初始體重，玉米油組小鼠體重減輕了3.17%，而損傷組小鼠體重減輕了5.20%，但這兩組小鼠之間的體重變化無顯著性差異（p>0.05）。元寶楓籽油組小鼠體重較初始體重增長了0.17%，其恢復初始體重程度較玉米油組和損傷組大，且具有顯著性差異（p<0.05）。

圖1 元寶楓籽油對LPS處理后小鼠體重變化的影響Fig.1 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on body weight changes in LPS-treated mice

2.2 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠臟器指數(shù)的影響

如表1，各組之間小鼠的心臟指數(shù)及腎臟指數(shù)差異都無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。而LPS損傷組小鼠的肝臟及脾臟指數(shù)較正常組小鼠升高，睪丸指數(shù)較正常組小鼠降低，且具有顯著性差異（p>0.05），這一結(jié)果提示了LPS處理對小鼠的肝臟、脾臟、睪丸具有潛在的毒性作用。而玉米油組和元寶楓籽油組小鼠的肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)較LPS損傷組小鼠降低，其睪丸指數(shù)較LPS損傷組小鼠升高，但無顯著性差異（p>0.05）。

表1 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠臟器指數(shù)的影響（%）Table 1 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on organ index in LPS-treated mice

2.3 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸長度，重量與長度比的影響

結(jié)腸的重量、長度是評價腸道炎癥疾病所致腸壁增厚程度和炎癥強度的重要指標，特別是結(jié)腸重量與長度比能有效反映疾病發(fā)展的進程[17]。與正常組相比而言，LPS處理能顯著造成小鼠結(jié)腸長度縮短至11.52 cm（圖2，p<0.05）。同時，相比于正常組小鼠，LPS處理還顯著造成了結(jié)腸重量與長度比的升高至4.91 mg/mm（p<0.05）。而元寶楓籽油干預7 d后腸道損傷小鼠腸長度恢復至11.82 cm，改善了LPS所致腸道炎癥模型小鼠結(jié)腸縮短的情況。此外，元寶楓籽油還能有效降低模型組小鼠結(jié)腸重量（至508.26 mg）和結(jié)腸重量與長度比（4.21 mg/mm）（p<0.05）。

圖2 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸長度（a）、結(jié)腸重量（b）及結(jié)腸重量與長度比（c）的影響Fig.2 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on colon length(a), weight (b) and colon weight to length (c) in LPS-treated mice

2.4 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸病理改變的影響

通過觀察組織切片發(fā)現(xiàn)（圖3a～d），與正常組相比，LPS誘導損傷組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)腸壁結(jié)構(gòu)破壞，上皮細胞壞死，炎性細胞浸潤嚴重等病理改變。玉米油干預對LPS腸道損傷模型小鼠結(jié)腸組織黏膜的毀損，炎性細胞浸潤等情況沒有得到較好改善。而連續(xù)灌胃元寶楓籽油7 d后，小鼠結(jié)腸組織上皮結(jié)構(gòu)明顯恢復正常，隱窩腺較完整，炎性細胞浸潤減少，絨毛清晰。結(jié)果表明元寶楓籽油能夠改善腸道黏膜屏障功能，促進黏膜修復。

圖3 楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸病理改變（a～d）及結(jié)腸中MPO與MDA水平（e、f）的影響Fig.3 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on pathological changes, MPO and MDA in colon of LPS-treated mice

2.5 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸組織中MPO酶活性與MDA水平的影響

MPO是嗜中性多形核白細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的特異性功能標志并能夠反映其活化程度，主要存在于髓系細胞的嗜苯胺藍顆粒中。MPO的活化狀態(tài)不僅與急性或慢性炎癥狀態(tài)下組織損傷有關(guān)，還參與細胞間信號作用的各種生理過程并能作為判斷腸道炎癥強度的有效指標[18]。同時，機體組織中過度的炎性反應同時也會引發(fā)細胞的氧化應激損傷，引發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化反應從而造成MDA與氧化/亞硝化應激生物標志物4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）的升高[19]。由圖3b可知，腹腔注射LPS處理能顯著引發(fā)小鼠結(jié)腸中MPO酶活性及MDA水平的升高（p<0.05）。相反，元寶楓籽油處理則能顯著抑制LPS誘發(fā)的炎癥小鼠結(jié)腸中MPO活性及MDA水平（p<0.05），且相較于LPS損傷組小鼠降低了28.25%和35.10%，而較玉米油組降低了19.63%和30.43%。本研究結(jié)果提示元寶楓籽油可能通過調(diào)控MPO酶活性，減輕中性粒細胞浸潤程度；同時減輕損傷小鼠腸道中過度氧化應激產(chǎn)物MDA的生成，從而逆轉(zhuǎn)LPS所造成的小鼠結(jié)腸組織的炎性反應及氧化應激損傷。此外，研究報道神經(jīng)酸干預能夠增強大鼠腦組織中谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）及γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-glutamate cysteine ligase，γ-GCL）活力，升高大腦還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量并降低MDA水平從而改善1-溴丙烷染毒所造成的大鼠認知功能損傷[20]。

2.6 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠血清中炎性細胞因子水平的影響

在炎癥反應的刺激下，機體的免疫系統(tǒng)會發(fā)生紊亂，而免疫細胞會過度分泌一系列炎性細胞因子（如IL-1β，IL-6，IL-18，TNF-α）[21]。其中，IL-1β與TNF-α具有協(xié)同作用，能共同誘導內(nèi)皮細胞表達黏附分子，促進白細胞黏附，從而導致腸道組織損傷加重[22,23]。而IL-6和IL-18則是通過加強炎性細胞因子的級聯(lián)反應，造成炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生，最終引起局部炎癥反應[24]。如圖4所知，相較于正常組，LPS損傷組的小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均有顯著提高（p<0.05）。而玉米油組小鼠血清中細胞因子水平與LPS損傷組小鼠相比，IL-1β、IL-6、IL-18水平均有下降，TNF-α水平則略有上升，但差異均無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。相反，元寶楓籽油組小鼠血清中細胞因子水平與LPS損傷組小鼠相比，IL-1β水平下降27.40%、IL-6水平下降24.80%、IL-18水平下降17.80%、TNF-α水平下降30.50%，且差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。元寶楓籽油組小鼠血清中細胞因子含量與玉米油組相比，IL-1β下降22.70%、IL-6下降20.40%、IL-18下降9.90%、TNF-α下降31.80%，且差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。結(jié)果表明，元寶楓籽油干預能夠下調(diào)小鼠血清中細胞因子水平，控制腸道組織中炎癥反應的進程。此外，李彤與孫紅偉的[12]研究結(jié)果也提示，元寶楓油可明顯降低一次性力竭運動大鼠體內(nèi)血清中炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的水平。

圖4 元寶楓籽油對LPS損傷小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量的影響Fig.4 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on serum levels of IL-1β，IL-6，IL-18 and TNF-α in LPS-induced mice

2.7 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸組織中炎性細胞因子水平的影響

結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平的升高是腸道炎癥的重要特征之一[25]。由于免疫系統(tǒng)處于紊亂狀態(tài)，異常激活的TNF-α通過誘導杯狀細胞丟失，破壞結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)，減薄結(jié)腸黏膜層厚度，促使炎性細胞因子侵襲，進而加速炎癥發(fā)展[26]。元寶楓籽油含有大量的神經(jīng)酸，神經(jīng)酸不僅有助于腦部疾病治療，還具有增強機體免疫力的作用[27]。王熙才等[10]研究結(jié)果也提示，元寶楓籽油處理能夠有效促進小鼠體內(nèi)淋巴細胞增殖，增強小鼠免疫系統(tǒng)。如圖5所示，LPS損傷組的小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平相較于正常組均有顯著提高（p<0.05）。玉米油組小鼠結(jié)腸組織中細胞因子水平與損傷組相比，IL-6與IL-18水平略有下降，而IL-1β、TNF-α水平略有上升，但差異都無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；元寶楓籽油組小鼠結(jié)腸組織中細胞因子水平與LPS損傷組相比，IL-1β下降14.50%、IL-6下降23.10%、IL-18下降27.40%、TNF-α下降20.90%，且差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。元寶楓籽油組小鼠結(jié)腸組織中細胞因子水平與較玉米油組相比，IL-1β下降12.80%、IL-6下降18.30%、IL-18下降19.80%、TNF-α下降20.30%，且差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。結(jié)果提示元寶楓籽油可能通過糾正腸道免疫系統(tǒng)，抑制免疫細胞異常分泌炎性細胞因子，進而改善腸道炎癥疾病。

圖5 元寶楓籽油對LPS損傷小鼠結(jié)腸組織中的IL-1β，IL-6，IL-18和TNF-α含量的影響Fig.5 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on the colon levels of IL-1β、IL-6、IL-18 and TNF-α in LPS-induced mice

2.8 元寶楓籽油干預對LPS處理后小鼠結(jié)腸組織中Nlrp3，Asc，Caspase1和Il1β的mRNA轉(zhuǎn)錄影響

亞油酸是一種重要的功能性多不飽和脂肪酸，具有降血脂，抗癌，預防動脈有樣硬化等生理功能，同時還參與機體免疫調(diào)節(jié)[28]。有研究認為亞油酸對炎癥反應具有積極作用，能夠抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和caspase-1等相關(guān)因子的表達，促進傷口愈合，緩解炎癥水平[29,30]。但是，亞油酸的氧化產(chǎn)物能增加炎癥介質(zhì)生成，改變免疫細胞功能，從而加速誘導炎癥反應的發(fā)生[31,32]。喬謙等[7]調(diào)查了我國天然分布區(qū)內(nèi)14個種源的元寶楓籽油后發(fā)現(xiàn)，元寶楓籽油中富含約91.47%的不飽和脂肪酸[其中，亞油酸（32.97%）、油酸（25.19%）、神經(jīng)酸（5.76%）、亞麻酸（2.76%）]及豐富的維生素E，具有良好的抗氧化作用。而玉米油則是以ω-6脂肪酸亞油酸為主的一類食用植物油，亞油酸含量高達51.7%[33]。如圖6示，LPS處理顯著造成小鼠結(jié)腸組織中Nlrp3、Asc、Caspase1和Il1β的m RNA表達水平增加（p<0.05）。與正常組小鼠相比，LPS處理的模型組小鼠結(jié)腸中Nlrp3表達水平上升約11.49倍，Asc表達水平上升5.16倍，Caspasee1表達水平升高7.17倍和Il1β表達水平升高10.23倍。而分別經(jīng)玉米油和元寶楓籽油處理后，LPS處理后小鼠結(jié)腸組織中Nlrp3、Asc、Caspase-1和Il-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于LPS模型小鼠（p<0.05）。與LPS損傷組相比，元寶楓籽油干預能夠分別抑制Nlrp3（41.80%）、Asc（49.85%）、Caspase-1（31.28%）和Il-1β（39.83%）的mRNA表達。Xie等[27]研究結(jié)果也同時提示經(jīng)18周飼喂富含亞油酸（7%玉米油提供）的新鮮飼料能有效下調(diào)自發(fā)結(jié)腸炎模型鼠（Il-10-/-小鼠）結(jié)腸組織中Il-1β等炎癥因子的表達水平。

圖6 元寶楓籽油對LPS損傷小鼠結(jié)腸組織中Nlrp3、Asc、Caspase1和Il1β的mRNA轉(zhuǎn)錄影響Fig.6 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on mRNA levels of Nlrp3, Asc, caspase-1 and Il1β in colon of LPS-treated mice

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，元寶楓籽油能有效緩解LPS誘導腸道損傷小鼠體重減輕和結(jié)腸縮短，抑制結(jié)腸組織上皮細胞凋亡，修復炎性反應所致腸黏膜損傷，進而恢復腸道屏障功能。能通過下調(diào)NLRP3炎性小體相關(guān)分子Nlrp3、Asc、Caspase1和Il1β的mRNA表達來改善腸道炎癥反應。此外，元寶楓籽油還能減少結(jié)腸炎小鼠血清與結(jié)腸組織中炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18）的生成，降低結(jié)腸中MPO活性及MDA生產(chǎn)水平。綜上所述，元寶楓籽油對腸道炎性損傷小鼠具有較好的組織修復和抗炎作用。