陳 穎，吳 斌，楊明柳，高霆煒

(廣西科學院廣西紅樹林研究中心，廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西北海 536000)

0 引言

有孔團水虱(SphaeromaterebransBate,1866)隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼動物亞門(Crustacea)軟甲綱(Malacostraca)等足目(Isopoda)團水虱科(Sphaeromatidae)團水虱屬(Sphaeroma)[1]。近年來，廣西北海市小冠沙、垌尾和海南東寨港等地相繼出現(xiàn)了團水虱暴發(fā)致使紅樹林大規(guī)模死亡的現(xiàn)象，危害嚴重[2,3]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，危害廣西紅樹林的種類主要為有孔團水虱[4]。當前，團水虱生物學特征的相關(guān)研究已有報道[5,6]，其繁殖生物學的研究也略有涉及，主要是基于宏觀現(xiàn)象觀察得出的結(jié)論[5,7,8]。李秀峰[5]研究海南東寨港有孔團水虱的抱卵率、繁殖群體組成、繁殖力等宏觀數(shù)據(jù)，得出東寨港有孔團水虱全年都可以繁殖的結(jié)論，這一結(jié)論與Thiel[7]研究美國佛羅里達紅樹林區(qū)有孔團水虱的結(jié)論一致。然而，從微觀生物學的角度，通過觀察團水虱的卵子發(fā)生，進行其繁殖特性的研究尚未見報道。本文采用組織切片技術(shù)，探究廣西紅樹林區(qū)有孔團水虱的卵子發(fā)生過程，并結(jié)合幼蟲的觀察結(jié)果，探討其繁殖期時間，以期為團水虱的防控、消殺和保護紅樹林生態(tài)系統(tǒng)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

有孔團水虱，取自廣西北海小冠沙紅樹林(21°24′51.35″N，109°10′18.28″E)的白骨壤枯死樹干，隨機選取并截斷樹干，收集其內(nèi)的有孔團水虱。采樣時間：2017年9月-2018年8月。2017年9月-2018年3月，約每半個月采集樣品1次；2018年4-8月，約每個月采集樣品1次，共采集到15批次的有孔團水虱樣品。采集樣品的同時，記錄當天的采樣地上是否存在該物種幼蟲。

樣品帶回實驗室，每批次分別隨機選取個體完整的成體100只，置于廣口瓶中，Bouin's 固定液固定7 d，無水乙醇浸泡洗滌3次，然后保存于無水乙醇中待用。

1.2 方法

從每批有孔團水虱樣品中隨機挑選雌性成體4個，參考芮菊生等[9]的方法，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，徠卡RM2235切片機切片(厚度6 μm)，蘇木精-伊紅(H-E)染色，中性樹膠封片。組織切片在Olympus BX51生物顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵子發(fā)生

根據(jù)組織切片觀察結(jié)果，將有孔團水虱的卵子發(fā)生劃分為4個時期：卵原細胞、無卵黃卵母細胞、卵黃發(fā)生卵母細胞和成熟期卵母細胞。

2.1.1 卵原細胞(Oogonium,OG)

卵原細胞呈卵圓形或不規(guī)則形，體積小，長徑10-17 μm，短徑8-14 μm。細胞核多呈卵圓形或不規(guī)則形，一般位于細胞的中央，長徑4-9 μm，短徑3-9 μm；核占據(jù)細胞的絕大部分；核質(zhì)比較大。細胞質(zhì)稀薄而少(圖1a)。

2.1.2 無卵黃卵母細胞(Alecithic oocyte)

根據(jù)細胞的大小和形狀、細胞核與核仁的形態(tài)等，將本時期分為前期、中期和后期3個亞期。

2.1.2.1 前期無卵黃卵母細胞(OC1)

卵母細胞形狀不規(guī)則，體積增大約1倍，長徑15-32 μm，短徑12-26 μm。細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞的一側(cè)，長徑10-17 μm，短徑7-15 μm，其最顯著的變化就是體積膨大。此時期的細胞核為生發(fā)泡，細胞的核質(zhì)比在各時期卵細胞中最大。細胞質(zhì)少量增長，嗜堿性增強。卵母細胞周邊出現(xiàn)稀疏的橢圓形濾泡細胞(圖1b)。

2.1.2.2 中期無卵黃卵母細胞(OC2)

卵母細胞形狀不規(guī)則，多接近長條狀，體積明顯增大，長徑28-43 μm，短徑8-25 μm。細胞核橢圓形、圓形或不規(guī)則，體積變小，位于卵母細胞靠近卵巢壁的部位，長徑11-22 μm，短徑6-13 μm。細胞質(zhì)明顯增多，呈嗜堿性。濾泡細胞零星分布，體積略有增大，形狀不規(guī)則(圖1c)。

2.1.2.3 后期無卵黃卵母細胞(OC3)

卵母細胞由近長條形逐漸膨大變成近橢圓形、圓形或不規(guī)則形，長徑32-66 μm，短徑8-28 μm。細胞核長徑12-21 μm，短徑8-13 μm。當細胞處于初始的近長條形時，細胞核呈圓形或橢圓形，位置靠近卵巢壁的細胞基部，核質(zhì)比大大降低。核仁清晰可見，位于細胞核的中央或一側(cè)，呈卵圓形，嗜堿性較強。核內(nèi)染色質(zhì)減少，核質(zhì)染色變淺，嗜堿性減弱。核膜清晰可見。細胞質(zhì)嗜堿性減弱(圖1d、圖1e)。

當細胞逐漸膨大，細胞核逐漸向細胞另一端接近，有些細胞的核與核仁的形狀變得不規(guī)則，部分細胞的核仁開始解體消失，細胞核染色變淺，嗜堿性減弱，部分細胞的核膜開始變模糊。細胞質(zhì)嗜堿性減弱。顆粒狀濾泡細胞呈不規(guī)則，排列仍較為稀疏(圖1f)。

2.1.3 卵黃發(fā)生卵母細胞(Vitellogenic oocyte)

根據(jù)卵黃物質(zhì)的積累量情況，本文將其分為2個亞期——卵黃開始沉積時相的卵母細胞和卵黃充滿時相的卵母細胞。

2.1.3.1 卵黃開始沉積時相的卵母細胞(OC4)

卵母細胞體積有所增長但程度不大，長徑40-62 μm，短徑23-44 μm。此期細胞核和核仁的特點較后期無卵黃卵母細胞(OC3)變化不明顯，核的長徑19-30 μm，短徑12-21 μm。細胞質(zhì)增多，嗜酸性增強。該時期靠近卵巢壁附近的細胞，其邊緣開始有少量卵黃顆粒沉積，嗜酸性，呈淡粉紅色。濾泡細胞增多并逐漸排列緊密(圖1g、圖1h)。

2.1.3.2 卵黃充滿時相的卵母細胞(OC5)

卵母細胞形狀不規(guī)則，多為近圓形或橢圓形，體積顯著增大，長徑54-163 μm，短徑42-158 μm。細胞核呈圓形或不規(guī)則形，偏位，核膜模糊，嗜堿性減弱，染色變淺，有的細胞沒有觀察到細胞核或其核仁的存在。細胞質(zhì)中充滿大量的卵黃顆粒且?guī)缀跽紦?jù)整個細胞質(zhì)，嗜酸性顯著增強，染色變深。濾泡細胞呈圓形、橢圓形或形狀不規(guī)則，數(shù)量多，排列緊密并完全包圍每個卵母細胞并形成單層濾泡腔，且與卵母細胞的卵周隙極小(圖1i、圖1j)。

2.1.4 成熟期卵母細胞(Mature oocytes，OC6)

卵母細胞呈圓形、橢圓形或形狀不規(guī)則，體積相比前一時期的卵母細胞顯著增大數(shù)倍，長徑376-573 μm，短徑317-462 μm。沒有發(fā)現(xiàn)細胞核存在。卵黃顆粒大量增加，幾乎占據(jù)整個細胞質(zhì)，嗜酸性增強，呈深紅色。濾泡細胞大量消失(圖1k、圖1l)。

a、OG:卵原細胞;b、OC1:前期無卵黃卵母細胞;c、OC2:中期無卵黃卵母細胞;d、e、f、OC3:后期無卵黃卵母細胞;g、h、OC4:卵黃開始沉積時相的卵母細胞;i、j、OC5:卵黃充滿時相的卵母細胞;k、l、OC6:成熟期卵母細胞;EN：核仁;FC：濾泡細胞;N：細胞核;Y：卵黃顆粒

2.2 有孔團水虱體內(nèi)不同時期卵子的周年變化及其繁殖期

表1為經(jīng)過組織切片觀察后得出的有孔團水虱體內(nèi)卵子的周年變化情況。由表1可見，只有5只個體體內(nèi)僅含某一個時期的卵子或胚胎，其余個體均含2個或2個以上時期的卵子或胚胎，表明有孔團水虱卵細胞是分批成熟的。除了2月和3月的2次采樣外，其余月份的有孔團水虱個體體內(nèi)都存在成熟期卵母細胞或胚胎。

表1 廣西紅樹林區(qū)有孔團水虱體內(nèi)卵子(胚胎)的周年變化情況

2018年2月27日、 3月18日和4月10日的3次采樣中，采樣地樹干上未發(fā)現(xiàn)有孔團水虱的幼蟲，其他采樣時期均發(fā)現(xiàn)有孔團水虱幼蟲的存在——每個洞穴中的幼蟲數(shù)量少則幾只，多則有30多只，且幼蟲群的旁邊會伴有1只成年雌性有孔團水虱(圖2)。

圖2 廣西紅樹林區(qū)有孔團水虱的幼體

結(jié)合有孔團水虱體內(nèi)卵子的周年變化情況以及幼體存在的情況，基本可以判斷：廣西紅樹林區(qū)有孔團水虱的繁殖期為每年的4月至次年的1月。

3 討論

3.1 卵子發(fā)生分期依據(jù)與方法

目前，劃分甲殼動物卵子發(fā)生過程的方法會因不同的分期依據(jù)而不同，主要有2種劃分方法：一種方法的分期依據(jù)是卵細胞的大小、卵細胞的核質(zhì)比等。卵細胞被分為卵原細胞、小生長期的初級卵母細胞、大生長期的初級卵母細胞以及成熟期的卵母細胞等階段[10-12]。另外一種方法的分期依據(jù)為卵黃物質(zhì)的起源和形成變化情況等。卵細胞被分為卵原細胞、內(nèi)源性與外源性卵黃合成期的卵母細胞以及成熟期的卵母細胞等階段[13-16]。本研究采用第一種劃分方法。

在有孔團水虱的卵子發(fā)生過程中，其卵細胞的形態(tài)、大小、細胞核、細胞質(zhì)以及卵黃合成等情況都發(fā)生了明顯的變化。卵母細胞的形態(tài)由初始的卵圓形逐漸變成條狀或片狀等不規(guī)則形狀，隨著體積繼續(xù)增大,其形狀又慢慢接近圓形，最終成熟的卵母細胞一般為圓形或者橢圓形。核質(zhì)比初始時較大，當核質(zhì)比進一步增大到最大值時，又逐漸減小，隨著卵母細胞不斷趨于成熟，有的卵母細胞的細胞核未被發(fā)現(xiàn)，直至卵母細胞成熟時，所有卵母細胞的細胞核都未能被發(fā)現(xiàn)。卵黃顆粒的逐漸積累使得細胞體積不斷變大，其由靠近卵巢壁一端的位置開始由少而多地沉積，直至最終幾乎充滿整個卵母細胞。濾泡細胞由無變有，由稀疏分布變?yōu)榫o密包圍每個卵母細胞。綜合上述過程的變化情況，本研究將有孔團水虱的卵子發(fā)生劃分為卵原細胞、無卵黃卵母細胞、卵黃發(fā)生卵母細胞和成熟期卵母細胞4個階段。

3.2 成熟卵母細胞的界定

成熟卵母細胞的界定對于判斷其能否進行受精和胚胎的發(fā)育，進而判定該物種是否進入繁殖期有重要意義。界定不同甲殼動物成熟卵母細胞的依據(jù)也各有不同：東方扁蝦(Thenusorientalis)成熟卵細胞的判斷依據(jù)是髓樣小體出現(xiàn)于卵黃內(nèi)，以及卵殼的形成等[13]；凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)和長毛對蝦(Penaeuspenicillatus)則是以卵母細胞的周邊位置出現(xiàn)皮質(zhì)棒且細胞核消失作為卵母細胞成熟的標志[17,18]；鋸緣青蟹(Scyllaserrata)的細胞核將要消失是其卵母細胞成熟的標志[19]；中國龍蝦(Panulirusstimpsoni)成熟卵母細胞的標志則是卵黃顆粒幾乎充滿整個細胞，核消失，次級卵膜和卵黃膜出現(xiàn)[12]。本研究中，有孔團水虱卵母細胞成熟標志是未見細胞核，卵黃顆粒幾乎充滿整個細胞，卵母細胞體積達到最大值，這與中國龍蝦、中華鋸齒米蝦(Neocaridinadenticulatasinensis)、日本新糠蝦(Neomysisjaponica)、武湖日本沼蝦(Macrobrachiumnipponensis)等[10,12,20,21]的成熟卵母細胞有相似之處。

3.3 有孔團水虱的繁殖期

本研究結(jié)果顯示，除2月和3月2次采樣的有孔團水虱個體外，其余月份的個體體內(nèi)都存在成熟期卵母細胞或胚胎。此外，除2018年2月27日、 3月18日和4月10日的3次采樣中沒有在采樣地樹干上發(fā)現(xiàn)有孔團水虱的幼蟲外，其他采樣時期中均發(fā)現(xiàn)幼蟲，故有孔團水虱的繁殖期為每年的4月至次年的1月。該結(jié)論與文獻[2,7]報道的有孔團水虱全年均可繁殖的結(jié)論不一致。并且該結(jié)論與李秀鋒[5]的有孔團水虱的繁殖力程度在3月最大的結(jié)論相悖。這可能是各個研究的團水虱其分布地點不同造成的，不同地方其環(huán)境因子不同，故有孔團水虱的繁殖習性也可能出現(xiàn)差異。有研究發(fā)現(xiàn)，溫度是影響有孔團水虱繁殖習性的主要因素[7,22]，棲息地不同溫度差異比較大時，團水虱的繁殖期就會有所不同。海南東寨港常年平均溫度比廣西北海高，這可能是東寨港有孔團水虱全年都可以繁殖的原因。這種因棲息地溫度的差異對甲殼動物廣布種繁殖期的影響是很常見的現(xiàn)象。此外，有孔團水虱的繁殖習性還可能受到海水鹽度等其他環(huán)境因子的影響[7]，這方面影響機制還有待進一步研究。根據(jù)廣西北海紅樹林區(qū)有孔團水虱2-3月不能繁殖的特性，在開展團水虱防控時，建議在每年的2-3月對紅樹林區(qū)的有孔團水虱采取消殺措施，這樣才能大量撲滅有孔團水虱成體，防止有孔團水虱再次進入繁殖期而大量暴發(fā)。

4 結(jié)論

本次調(diào)查表明，廣西北海市小冠沙紅樹林區(qū)有孔團水虱雌性體內(nèi)全年存在著各時期的卵母細胞或胚胎；2-3月無成熟期卵母細胞或胚胎出現(xiàn)。結(jié)果顯示，有孔團水虱的繁殖期為每年的4月至次年的1月。該結(jié)論可為廣西北海市小冠沙紅樹林區(qū)有孔團水虱的防治與消殺提供參考。