杜明紅，周云，劉成軍

(1.重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院 兒科，重慶 408000; 2.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，重慶 400000)

支氣管哮喘是兒科最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，目前傳統(tǒng)的治療藥物以控制癥狀、減少發(fā)作頻率為主要目的[1]。對于疾病進展風險的評估，例如急性發(fā)作、肺功能下降、長期用藥引起的不良反應(yīng)等，都應(yīng)納入臨床治療考慮的范疇。由于支氣管哮喘患兒氣道炎癥可能持續(xù)存在，即使臨床癥狀得到緩解，但并不能證明已達到治療目的[2]。因此，探索新的治療靶點尤其是與氣道炎癥相關(guān)的分子機制，對于新型藥物研發(fā)具有重要的指導(dǎo)價值。眾多miRNAs被證實在肺部疾病的發(fā)生、進展過程中扮演著關(guān)鍵角色，例如唐晉等[3]發(fā)現(xiàn)miR-98-5p可靶向TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的肺泡巨噬細胞向M2型分化，從而減輕肺部炎癥并保護肺泡組織的正常結(jié)構(gòu)及功能。但是miR-98-5p是否可作為支氣管哮喘治療的分子靶點尚需要臨床證據(jù)的支持。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)是miR-98-5p的下游靶蛋白[4]。Chong等[5]已通過小鼠模型證實，STAT3與哮喘發(fā)病機制有潛在聯(lián)系。本研究擬探討支氣管哮喘患兒肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中miR-98-5p和靶蛋白STAT3的表達變化及其與氣道炎癥的相關(guān)性，為尋找疾病進展和臨床療效的評估指標以及將來靶向藥物的開發(fā)提供一定的證據(jù)支持。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2020年5月于重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院就診的120例支氣管哮喘患兒作為哮喘組，包括72例急性發(fā)作期患兒(BA-E組)和48例緩解期患兒(BA-R組)。其中，男87例，女33例；年齡1～12歲，平均(6.80±3.02)歲。納入標準：(1) 符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]診斷標準。急性發(fā)作期定義為患者臨床癥狀(包括呼吸困難程度、呼吸頻率、脈搏頻率等)和肺功能出現(xiàn)急性或亞急性惡化；臨床緩解期定義為經(jīng)或不經(jīng)治療，癥狀體征消失，肺功能恢復(fù)至急性前水平，并維持3個月以上。(2) 4周內(nèi)沒有接受皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或炎癥遞質(zhì)拮抗劑治療。排除標準：(1) 有變異性哮喘或其他過敏性疾病史者；(2) 4周內(nèi)發(fā)生嚴重感染者；(3) 合并炎癥性疾病、惡性血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤或先天性疾病者。另外納入20例因呼吸道發(fā)育畸形(3例)或支氣管異物(17例)入院就診的患兒作為對照組，排除感染病史、過敏性疾病史、免疫疾病史。其中男11例，女9例；年齡1～12歲，平均(6.40±3.19)歲。兩組基本資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準；所有參與者的監(jiān)護人在招募前提供了書面的知情同意書。

表1 3組入組受試兒童臨床資料對比

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 樣本收集及處理 根據(jù)歐洲呼吸學會兒童肺泡灌洗術(shù)的操作指南，所有患兒采用喉罩式氣道和柔性支氣管鏡(Olympus BF-3C160型，日本奧林巴斯公司)在全身麻醉下進行灌洗；從右肺葉中段收集灌洗液，1 ml·kg-1·次-1，20～40 min·次-1。將BALF分為兩部分：一部分用于病原學培養(yǎng)；另一部分離心，取細胞沉渣用于細胞學分析，取上清用于提取總RNA和細胞因子檢測。

1.2.2 提取總RNA并采用實時熒光定量PCR法檢測miR-98-5p相對表達量 采用mirVana miRNA Isolation Kit(美國Ambion公司)提取BALF總RNA，使用MicroRNA TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan MicroRNA檢測(美國Applied Biosystems公司)進行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性10 min，然后進行40個循環(huán)(95 ℃→60 ℃→72 ℃)，收集熒光信號。數(shù)據(jù)分析使用Livak和Schmittgen等描述的2-ΔΔCt方法。將數(shù)據(jù)用U6 mRNA內(nèi)參校正。凈循環(huán)閾值(net cycle threshold，CT)被用來計算每個樣本的ΔCT值，使用U6 mRNA的平均CT作為參考。U6是miR-106a的內(nèi)參。miR-98-5p正向序列為5′-TGCAGTAGATCTCAAAAAGCTACC-3′，反向序列為5′-CCTTGGCCATGTAAAAGTGC-3′，產(chǎn)物長度54 bp；U6正向序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向序列為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′，產(chǎn)物長度為79 bp。

1.2.3 ELISA法檢測STAT3和氣道炎癥相關(guān)炎癥因子的表達量 采用ELISA試劑盒檢測BALF中白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-13、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、總免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)。用試劑盒提供的標準品制作標準曲線，用線性回歸分析確定標準曲線中的細胞因子濃度。所有實驗均按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 肺功能檢查 使用PonyFX型肺功能儀(意大利COSMED公司)對哮喘患兒的肺功能進行檢測，包括最大程度的深呼吸后用力呼氣第1秒時候的氣量容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、FEV1/FVC、用力呼氣25%容量(MEF25)、MEF50、MEF75。檢測前應(yīng)穩(wěn)定患兒情緒，并告知家長和兒童配合檢查，對于5歲以下患兒，盡量在患兒熟睡狀態(tài)下連續(xù)完成5次測試，若無法配合操作時，可以使用口服水合氯醛和鼻塞麻黃素滴鼻進行鎮(zhèn)靜，但整個過程應(yīng)嚴格控制藥物用量。

1.2.5 FeNO檢測 受試患兒靜坐，進行最大呼氣，50 ml·s-1為測試的呼氣流速，10 s(>6歲)或6 s(≤6歲)設(shè)定為呼出時間。采用NIOX一氧化氮測定儀(瑞典尼爾斯公司)檢測FeNO，檢測3次，取平均值。

1.2.6 雙熒光素酶報告分析 先用生物信息學軟件預(yù)測miR-98-5p的靶點為STAT3，為了驗證兩者的靶向結(jié)合關(guān)系，將含有miR-590-5p結(jié)合位點的野生型或突變型STAT3 3′-UTR片段克隆到pmirGLO載體(美國Promega公司)。然后，用脂質(zhì)體2000試劑(美國Invitrogen公司)將HEK293T細胞與pmirGLO載體及miR-98-5p模擬物共轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后，取細胞進行裂解。使用雙熒光素酶報告測定系統(tǒng)(美國Promega公司)檢測螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度值，以反映不同處理組的相對熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 3組受試兒童BALF中miR- 98- 5p和STAT3水平

與對照組相比，BA-E組和BA-R組BALF中miR-98-5p相對表達量降低，STAT3水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而且與BA-R組相比，BA-E組miR-98-5p和STAT3水平變化更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試兒童BALF中miR-98-5p和STAT3水平

2.2 生物信息學分析miR- 98- 5p和STAT3的靶向關(guān)系

生物信息學分析(TargetScan和microRNA.org)結(jié)果顯示，miR-98-5p存在與STAT3 mRNA靶向結(jié)合的

A. TargetScan在線軟件預(yù)測miR-98-5p和STAT3 mRNA互補的保守序列；B. 雙熒光素酶報告基因分析驗證

保守序列(圖1A)。根據(jù)雙熒光素酶報告基因分析，miR-98-5p顯著抑制包含野生型STAT3 3′-UTR的報告載體的熒光素酶活性(圖1B)。然而，miR-98-5p對包含突變體STAT3 3′-UTR的報告載體的熒光素酶活性沒有明顯的影響(圖1B)。

2.3 哮喘患兒肺功能、FeNO、氣道炎癥相關(guān)因子檢測

與BA-R組相比，BA-E組FEV1、FEV1/FVC以及BALF中IL-10水平降低(均P<0.001)，同時FeNO和BALF中IL-6、IL-13、TNF-α、總IgE水平均增加(均P<0.05)，見表3。

表3 2組哮喘患兒肺功能、FeNO、氣道炎癥相關(guān)因子檢測結(jié)果

2.4 哮喘患兒BALF中miR- 98- 5p及STAT3與氣道相關(guān)炎癥因子的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，哮喘患兒BALF中miR-98-5p與STAT3呈負相關(guān)(r=-0.659,P<0.05)，同時與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE亦呈負相關(guān)(均r<0,P<0.001)，與IL-10水平則呈正相關(guān)(r=0.288,P=0.001)；而BALF中STAT3水平與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE均呈正相關(guān)(均r>0,P<0.001)，與IL-10水平則呈負相關(guān)(r=-0.285,P<0.001)。見圖2。

圖2 哮喘患兒BALF中miR-98-5p及STAT3與氣道相關(guān)炎癥因子的相關(guān)性

3 討 論

氣道炎癥是支氣管哮喘最主要病理特征之一，多與組織損傷、細胞因子及生長因子的大量釋放有關(guān)，可導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和氣道平滑肌重塑[7]。氣道炎癥涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，例如STATs通路等，這可能是影響氣道炎癥反應(yīng)持續(xù)時間和強度的關(guān)鍵分子機制[8-10]。本研究結(jié)果顯示miR-98-5p與STAT3存在靶向結(jié)合關(guān)系，哮喘患兒BALF中miR-98-5p相對表達量降低，同時STAT3水平升高，且兩者與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE、IL-10等炎癥因子水平存在一定的相關(guān)性，說明miR-98-5p/STAT3軸可能是通過影響炎癥因子參與哮喘的發(fā)生進展過程。

miR-98-5p在多種疾病中被證實屬于炎癥相關(guān)miRNAs。唐晉等[3]通過建立大鼠急性肺損傷模型發(fā)現(xiàn)，過表達miR-98-5p可明顯緩解大鼠肺部病理學改變，降低BALF中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平，同時增加抗炎因子IL-10的分泌，說明上調(diào)miR-98-5p可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)并保護肺泡組織的正常結(jié)構(gòu)及功能。劉繼紅等[11]通過細胞實驗證實，miR-98可能通過負性調(diào)控NF-κB信號通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化早期血管內(nèi)皮損傷過程。本研究BA-E組和BA-R組哮喘患兒BALF樣本中miR-98-5p相對表達量較對照組兒童降低，而且與BA-R組患兒相比，BA-E組患兒BALF樣本中miR-98-5p降低水平更明顯。這些證據(jù)都證實miR-98-5p可能參與了哮喘發(fā)病和進展過程。哮喘患兒BALF中miR-98-5p與促炎因子IL-6、IL-13、TNF-α、IgE水平呈負相關(guān)，而與抗炎因子IL-10水平則呈正相關(guān)，說明哮喘患兒BALF中miR-98-5p表達降低與氣道炎癥反應(yīng)存在一定的關(guān)聯(lián)，可能通過加重氣道炎癥反應(yīng)進而誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作。

為了探討miR-98-5p在哮喘中的作用機制，本研究分析了其潛在靶基因之一STAT3在BALF中的水平變化。STATs屬于細胞因子和生長因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族，在免疫和體液反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[12]。在細胞因子刺激下，STATs通過受體相關(guān)JAK激酶家族成員酪氨酸殘基的磷酸化而被激活[13]。Src激酶家族也被證明通過生長因子和細胞因子介導(dǎo)STAT酪氨酸磷酸化；這種磷酸化通過對-Tyr-SH2結(jié)構(gòu)域相互作用導(dǎo)致構(gòu)象變化，從而使STATs轉(zhuǎn)移到細胞核，在那里它們與序列特異性、DNA結(jié)合元件結(jié)合以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[14]。Chong等[5]證實，瘦素可通過激活STAT3信號通路誘導(dǎo)肥胖性哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。Yu等[15]亦證實，糖皮質(zhì)激素通過抑制MEK/JAK/STAT信號通路的激活調(diào)節(jié)ILC2s的轉(zhuǎn)錄表達，進而有效地降低氣道炎癥反應(yīng)，達到緩解癥狀的目的。 本研究BA-E組和BA-R組BALF樣本中STAT3水平均高于對照組，同時BALF中STAT3水平與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE均呈正相關(guān)，與IL-10水平則呈負相關(guān)。說明STAT3與促炎因子激活有關(guān)，這與之前的發(fā)現(xiàn)基本一致。通過TargetScan數(shù)據(jù)庫檢索和雙熒光素酶報告基因分析證實，STAT3是miR-98-5p的靶標之一，而且通過Pearson相關(guān)性分析，哮喘患兒BALF中miR-98-5p與STAT3呈負相關(guān)，說明miR-98-5p/STAT3軸與哮喘患兒氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)，可能在哮喘中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，miR-98-5p/STAT3 軸被證明與哮喘患者肺通氣功能有關(guān)。這可能是：(1) miR-98-5p表達降低可激活STAT3等炎癥相關(guān)因子的表達，進而通過提高炎癥細胞因子水平加重反應(yīng)，從而增加了哮喘急性發(fā)作的風險；(2) miR-98-5p/STAT3 軸也可能通過招募炎癥細胞引起支氣管和肺泡細胞損傷，從而加重肺部炎癥，提高哮喘疾病惡化的風險。因此，局部阻斷STAT3或上調(diào)miR-98-5p相對表達量可能是未來治療或逆轉(zhuǎn)哮喘的一個有吸引力的策略。

綜上，支氣管哮喘患兒BALF中miR-98-5p相對表達量降低，同時STAT3蛋白水平升高，兩者存在一定的靶向調(diào)控關(guān)系。miR-98-5p/STAT3軸的激活在一定程度上可反映患兒氣道炎癥嚴重程度，進而為支氣管哮喘患兒的臨床治療和病情進展評估提供參考。