楊春霞

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏銀川750002）

枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，被廣泛用于醫(yī)藥、食療、養(yǎng)生、保健等領(lǐng)域，其化學(xué)成分類型豐富，主要包括多糖類[1]、蛋白質(zhì)氨基酸類[2]、黃酮類[3]、生物堿類[4]、類胡蘿卜素[5]、甾醇類、萜類等多種類型化學(xué)成分，被國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定為藥食同源的品種[6]。隨著人們的保健意識(shí)和食品安全意識(shí)增強(qiáng)，其生理作用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越來越被人們追捧。研究表明：枸杞有抑菌、抗突變、清除自由基、抗氧化、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[7]。枸杞之所以具有這些生理活性可能與其中的酚類成分有著一定關(guān)系。

枸杞多糖、黃酮等成分的研究已有大量報(bào)道[8-10]。近幾年，研究者對(duì)枸杞功能營(yíng)養(yǎng)成分總酚[11]、黑果枸杞汁中酚酸[12]、黑果枸杞花青素成分[13-14]展開了研究，比較了寧夏、新疆、青海、甘肅地區(qū)種植的枸杞總酚含量，研究枸杞總酚含量呈現(xiàn)的種植區(qū)域化[15]。張自萍等[16]、楊文等[17]采用高效液相色譜法測(cè)定了寧夏枸杞中綠原酸的含量。譚亮等[18]對(duì)青海產(chǎn)的不同品種枸杞中5種酚酸含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)比較了內(nèi)蒙古、甘肅、新疆及寧夏產(chǎn)枸杞中酚酸含量。劉少靜等[19]建立了同時(shí)測(cè)定黑果枸杞中綠原酸、咖啡酸、表兒茶素和阿魏酸含量的反相高效液相色譜法。楊春霞等[20]重點(diǎn)對(duì)寧夏4個(gè)產(chǎn)區(qū)種植的寧杞1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)中總酚含量進(jìn)行分析，比較了各產(chǎn)區(qū)、每個(gè)品種間夏果枸杞與秋果枸杞中總酚含量的差異性。本試驗(yàn)選取與枸杞藥理學(xué)作用有關(guān)的沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸為目標(biāo)物，以30%～40%的乙醇作提取劑，通過冷凝回流、鹽酸酸化、乙酸乙酯萃取提取枸杞中酚酸成分，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定枸杞中9種酚酸化合物的方法，以期為枸杞的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：中寧枸杞種植基地，采集成熟的寧杞1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和9號(hào)鮮果，樣品用液氮冷凍研磨后保存待用。

乙腈（色譜純）：Fisher Scientic公司；無(wú)水乙醇（優(yōu)級(jí)純）、磷酸溶液（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、阿魏酸（標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%）：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)用水為超純水（電導(dǎo)率小于 18.2 μs/cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀（配SPD-20A紫外檢測(cè)器）：日本島津公司；U3900紫外分光光度計(jì)：日本日立公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LD5-2A型高速冷凍離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；CHA-S恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；Milli-Q型超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司；

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、阿魏酸各5.0mg，用甲醇溶解，定容到10.00mL容量瓶中，濃度分別為0.5mg/mL。

用甲醇將對(duì)照品母液按不同倍數(shù)稀釋，制備系列混合對(duì)照品溶液，9種酚酸的濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、5.0、10.0、20.0、30.0 mg/L。4 ℃條件下冷藏備用。

1.3.2 枸杞樣品處理

稱取一定量的枸杞粉末，加入30%～40%乙醇溶液，料液比 1∶10（g/mL），在 25 ℃條件下振蕩 2 h，然后于水浴中回流2 h，回流后的液體過濾后進(jìn)行減壓蒸餾，蒸餾后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5～3.0，得到酸化液。酸化液中加入20 mL乙酸乙酯萃取，分離有機(jī)溶劑層，然后減壓濃縮去除殘留的乙酸乙酯，用無(wú)水乙醇復(fù)溶后過微孔濾膜，樣液供上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

2 結(jié)果及分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在波長(zhǎng)200 nm～400 nm對(duì)沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸、香豆酸、原兒茶醛對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，各標(biāo)準(zhǔn)品的最強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在240 nm～320 nm，綜合考慮，選取280 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)為宜。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化選擇

在酚酸的分離中，由于酚羥基和羧基在水溶液中容易發(fā)生電離，極性增強(qiáng)，在固定相表面形成雙重保留，色譜峰拖尾嚴(yán)重，如果加入酸性調(diào)節(jié)劑，可使酚酸的電離受到抑制，以中性分子的形態(tài)存在，極性減弱，有利于增強(qiáng)在固定相上的保留，使分離效果和峰形得到改善。試驗(yàn)采用不同配比的乙腈-水、甲醇-水為流動(dòng)相，流動(dòng)相的pH值通過不同的酸來調(diào)節(jié)。試驗(yàn)結(jié)果表明：選用甲醇-0.1%甲酸水溶液和80%甲醇-0.1%甲酸水溶液作流動(dòng)相，分析時(shí)間長(zhǎng)，分離效果不理想。采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，乙腈的體積分?jǐn)?shù)由5%變化到30%的梯度條件下分離效果最佳，9種酚酸在46 min內(nèi)可完全分離。

2.1.3 流速對(duì)分離度的影響

本研究設(shè)計(jì)了0.8、1.0、1.2mL/min3個(gè)流速，通過優(yōu)化出峰時(shí)間、分析時(shí)間和分離度，發(fā)現(xiàn)3個(gè)流速均能滿足9種酚酸同時(shí)分析，出峰效果均較好。考慮到樣品中雜質(zhì)會(huì)干擾目標(biāo)峰的確定，試驗(yàn)最終確定流速為1.0 mL/min。

2.1.4 溫度對(duì)分離度的影響

試驗(yàn)設(shè)定30、35、40℃3個(gè)柱溫進(jìn)行試驗(yàn)，通過優(yōu)化出峰時(shí)間、分析時(shí)間和分離度，發(fā)現(xiàn)柱溫30℃以上時(shí)分離度均能達(dá)到要求，試驗(yàn)最終選擇30℃為分析溫度。

2.1.5 酚酸的色譜保留行為

在最優(yōu)的色譜分離條件下對(duì)沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸進(jìn)行分離，結(jié)果見圖1。

圖1 9種酚酸化合物標(biāo)準(zhǔn)色譜分離圖Fig.1 The chromatogram of a mixture of nine phenolic acid standards

由圖1可知，9種酚酸化合物在46 min內(nèi)完全分離，出峰先后順序依次為沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸，分離效果良好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性試驗(yàn)

平行進(jìn)樣5次，對(duì)沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸標(biāo)樣進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定，考察保留時(shí)間、峰面積和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）的重現(xiàn)性，結(jié)果見表1。

由表1可知，不同酚酸的保留時(shí)間的RSD均≤1.04%，峰面積的RSD均≤0.91%，峰高的RSD均≤2.71%，試驗(yàn)條件下9種酚酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品都具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表1 酚酸標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間、峰面積和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 1 RSD of retention time，peak area and peak height of phenolic acid standards（n=5）

2.3 線性關(guān)系

配制酚酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1 mg/L～30.0 mg/L，以質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的響應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表2。

由表2可知，各酚酸的峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.993 7～0.999 1之間，據(jù)此確定在試驗(yàn)范圍內(nèi)儀器響應(yīng)信號(hào)與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（detection limit，LOD），沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸的LOD值分別為 0.07、0.10、0.10、0.12、0.08、0.09、0.10、0.10、0.10，方法檢出限低，能滿足分析要求。

表2 9種酚酸線性回歸方程及檢出限Table 2 Linear regression equations and detection limit of nine phenolic acids

2.4 方法準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

對(duì)枸杞樣進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品，通過添加不同水平的酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使最終濃度分別為5.0、10.0、20.0 mg/L。分別計(jì)算樣品的回收率，對(duì)方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表3。

表3 9種酚酸回收率和精密度（n=5）Table 3 Recoveries of 9 phenolic acids and precision of the method（n=5）

從表3可以看出，沒食子酸的平均回收率為73.5%～85.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～5.8%，香豆酸的平均回收率為80.3%～88.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～6.1%，原兒茶醛的平均回收率為77.9%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～6.7%，兒茶素的平均回收率為75.7%～81.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%～7.8%，綠原酸的平均回收率為63.6%～75.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6%～6.9%，咖啡酸的平均回收率為76.2%～92.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～7.9%，丁香酸的平均回收率為77.9%～79.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～6.3%，表兒茶素的平均回收率為74.4%～84.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～6.1%，阿魏酸的平均回收率為70.5%～81.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～4.3%。樣品的回收率、精密度均能滿足檢測(cè)要求，表明方法的準(zhǔn)確度高、精密度好，基本能滿足枸杞中9種酚酸的檢測(cè)要求。

2.5 枸杞中酚酸含量

依據(jù)建立的方法，對(duì)枸杞樣品中酚酸組分及含量檢測(cè)分析，結(jié)果見表4。

表4 枸杞中酚酸含量Table 4 Content of phenolic acid contents in Lycium barbarum L．mg/kg

由表4數(shù)據(jù)可知，寧杞1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)中沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸均被檢出，以沒食子酸和阿魏酸含量較高，其含量分別在 68.2 mg/kg～340.0 mg/kg、94.3 mg/kg～1 086.0 mg/kg，咖啡酸次之，含量在48.0 mg/kg～62.0 mg/kg，原兒茶醛、兒茶素和綠原酸的含量均很低，香豆酸、丁香酸和表兒茶素均未檢出。枸杞樣品及添加回收色譜圖見圖2。

圖2 枸杞樣品及添加回收色譜圖Fig.2 Sample and add recovery chromatography of the Lycium barbarum L．

3 結(jié)論

建立了9種酚酸同時(shí)分析的高效液相色譜法。通過方法學(xué)驗(yàn)證，兒茶素測(cè)定的線性范圍在0.2 mg/L～30.0 mg/L，其余8種酚酸測(cè)定的線性范圍在0.1 mg/L～30.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)大于0.990 0，各酚酸的平均回收率為63.6%～99.8%，RSD小于8%。方法準(zhǔn)確度高、精密度好，能滿足枸杞中9種酚酸同時(shí)分析的要求。