杜 煒，欒兆進(jìn)，宋慧子，王兆琛，趙勇超，張家新

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 010018）

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 附睪上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將附睪頭、體、尾組織分離，分別浸泡在加入PS的DPBS中使附睪組織中的精子成分上游，用眼科手術(shù)剪刀將組織剪成2～3mm小塊，并剔除其中結(jié)締組織，移入1mg/ml膠原蛋白酶Ⅳ中，37℃水浴震蕩消化30min，用孔徑為0.15mm不銹鋼濾網(wǎng)將消化液過(guò)濾，用DPBS沖洗濾網(wǎng)上的管狀組織塊，RPMI-1640培養(yǎng)基1350r/min離心5min清洗3次取得管狀組織塊，每個(gè)60皿中約放置60個(gè)塊，加入3mLRPMI1640培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、100nmol/L雄激素、50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素）37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待單層細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，去掉組織塊，即得原代附睪上皮細(xì)胞[1]。

1.2 附睪上皮細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞融合接近80%～90%時(shí)傳代，加入0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化2min，光鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落浮起時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮后，收集離心，重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶[2]。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞相關(guān)基因

使用TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ（Takara）對(duì)GPx5基因進(jìn)行相對(duì)定量試驗(yàn)。反應(yīng)條件如下:95℃、10min;95℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL:TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ（2×）10μL，cDNA2μL，上 下 游引 物 各0.8μL，ddH2O6.4μL。利用2-ΔΔct法 與β-actin進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算[3]。

表1 P66、SERPIN1、DCXR 、AK1和Clu基因引物序列

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng)

附睪上皮細(xì)胞，24h內(nèi)以球狀團(tuán)塊形式貼壁生長(zhǎng)。36h后，細(xì)胞團(tuán)逐漸變平并擴(kuò)散成單層，外觀呈菌落狀的生長(zhǎng)形態(tài)。原代附睪頭上皮細(xì)胞、附睪體上皮細(xì)胞3d內(nèi)達(dá)到融合。可以用0.25%胰蛋白酶消化傳代至少8～10次（傳代比率為1∶2）。相比之下，附睪尾上皮細(xì)胞培養(yǎng)7d才能融合。經(jīng)過(guò)4～5次傳代后，上皮細(xì)胞通常顯示細(xì)胞體積增大，形狀趨于扁平且不規(guī)則，并帶有大量胞質(zhì)液泡。

圖1 上皮細(xì)胞培養(yǎng)圖

2.2 附睪相關(guān)基因在附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞的表達(dá)差異

從p66mRNA、P34HmRNA、seRPINA1的基因表達(dá)量來(lái)看，附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞的基因表達(dá)量比較均存在顯著差異，且頭部＞體部＞尾部（P＜0.01）；從ak1mRNA來(lái)看，附睪頭部上皮細(xì)胞基因表達(dá)量顯著高于體部（P＜0.05）；從clumRNA看，附睪頭、體部的基因表達(dá)量顯著高于尾部（P＜0.01）（見(jiàn)圖2）

圖2 附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)差異

3 討論與結(jié)論

從p66mRNA，附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞的基因表達(dá)量比較均存在顯著差異，且頭部＞體部＞尾部（P＜0.01）；考慮p66mRNA的基因表達(dá)量在附睪的不同部位的上皮細(xì)胞間存在分布差異。在附睪頭、體、尾呈遞減性分布。研究顯示，體外胚胎發(fā)育能力下降與胚胎暴露于氧化應(yīng)激蛋白p66Shc環(huán)境下有關(guān)[4]。研究證實(shí)，綿羊合子階段注射p66SHc siRNA會(huì)導(dǎo)致p66mRNA的蛋白質(zhì)水平下降[5]。而敲定p66SHc 能夠提升胚胎的基因激活階段的抗氧化應(yīng)激能力。從正常綿羊附睪組織獲取的附睪頭、體、尾組織的p66mRNA基因分布情況看，決定綿羊附睪上皮細(xì)胞的生育、細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激能力的基因物質(zhì)主要集中在附睪頭部。

從clumRNA看，附睪頭、體部的基因表達(dá)量顯著高于尾部（P＜0.01）。clumRNA與多種疾病有關(guān)，CLU的功能多樣，但在不同的區(qū)域承擔(dān)的生物學(xué)特性有影響差異。而附睪頭、體部基因表達(dá)量高于尾部,可見(jiàn)，綿羊附睪上皮細(xì)胞的clumRNA主要存在于附睪頭、體部，在尾部含量少。綜上，在不同的附睪上皮細(xì)胞中，參與附睪的功能的主要基因分布情況存在一定差異，但主要以附睪頭、體部為主，尾部的上皮細(xì)胞的基因分布較低，與附睪尾端的生物功能有關(guān)。