張蔓娜萬(wàn)億田彬楊興林孫芳芳王欣

1貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心感染科550002；2貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心病理科550002；3貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心檢驗(yàn)科550002；4貴陽(yáng)市婦幼保健院藥劑科550001

肝纖維化是乙型肝炎惡變的必經(jīng)階段，嚴(yán)重危及患者的身心健康和生命安全?，F(xiàn)階段，針對(duì)肝纖維化的診斷主要基于肝組織活檢，由于該方法存在一定的創(chuàng)傷性及并發(fā)癥，推廣普及具有局限性[1]，故需要尋找其他安全、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、方便及可復(fù)檢的檢測(cè)方法[2]。研究表明，肝星狀細(xì)胞（HSC）活化相關(guān)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[3]，其中黏著斑激酶處于整合素β1及生長(zhǎng)因子等多種信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，與HSC活化相關(guān)通路密切相關(guān)[4-5]。因此，本研究檢測(cè)不同肝纖維化分期患者組織中黏著斑激酶和整合素β1的表達(dá)情況，同時(shí)分析它們的診斷效能可以為乙型肝炎肝纖維化診斷及防治提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選擇2018年10月至2020年8月在貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心診治的92例臨床資料完整的乙型肝炎患者作為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)血清學(xué)檢查確診為乙型肝炎，并符合乙型肝炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；肝纖維化符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：在參與本研究前半年內(nèi)接受過(guò)抗病毒、抗纖維化及免疫調(diào)節(jié)等影響本研究治療者；其他肝病患者；合并惡性腫瘤者；肝外器官纖維化、肝內(nèi)占位性病變及存在腹腔積液者；合并穿刺禁忌者。

根據(jù)肝穿刺活檢組織病理結(jié)果參照肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)[8-9]分為3組：A組為S0~S1級(jí)，共37例；B組為S2~S3級(jí)，共49例；C組為S4級(jí)，共6例。其中A組男24例、女13例；年齡（41.49±8.10）歲,范圍26～67歲；B組男34例、女15例；年齡（42.86±12.34）歲，范圍25～69歲；C組男4例、女2例；年齡（42.61±9.77）歲，范圍25～70歲。三組性別、年齡、病程、HBsAg陽(yáng)性率、ALT和AST的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。本研究試驗(yàn)對(duì)象均知情同意，并經(jīng)過(guò)貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：202111）。

表1 不同分期肝纖維化患者的一般資料比較

二、研究方法

1.樣本采集

通過(guò)肝穿刺活檢術(shù)，在超聲引導(dǎo)下，對(duì)肝組織進(jìn)行采集（切除位置邊緣無(wú)病變），采集的組織長(zhǎng)度不短于1.5 cm，將采集組織固定于10%的甲醛中，石蠟包埋連續(xù)切片厚4 μm。

2.熒光定量PCR

采用RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）提取組織總RNA。交由Takara公司設(shè)計(jì)黏著斑激酶、整合素β1和GAPDH引 物 （見(jiàn) 表2），然 后 參 照PrimeScript RT試劑盒（默沙克生物公司）的說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定反應(yīng)條件為：37℃，15 min×3次（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5 s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）。取反應(yīng)液予以熒光定量PCR，參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（默沙克生物公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR操作：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。采用相對(duì)定量法，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因黏著斑激酶、整合素β1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表2 黏著斑激酶、整合素β1和GAPDH引物序列

3.免疫組化

將組織切片放入60℃溫箱烘1 h，常規(guī)予以脫蠟脫水，后將其置于3%雙氧水中，37℃孵育0.5 h，磷酸緩沖液（PBS）沖洗后放入0.01 mol枸櫞酸緩沖液中，95℃煮沸20 min，冷卻至室溫，PBS沖洗。正常羊血清工作液封閉（37℃持續(xù)10 min）。滴加一抗：黏著斑激酶 （稀釋比為1∶50，Cell Signaling Technology公司）、整合素β1（稀釋比為1∶100，Santa Cruz Biotechnology公司），4℃過(guò)夜，PBS沖洗。滴加相應(yīng)的二抗（上海玉博生物科技有限公司）室溫孵育30 min，蘇木素（上海博谷生物科技有限公司）復(fù)染，封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（400×），每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

4.免疫印跡

對(duì)組織中總蛋白進(jìn)行提取及定量（蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，定量試劑盒采用BCA試劑盒），行SDS-PAGE后，予以PVDF轉(zhuǎn)膜，再封閉1 h，加一抗：黏著斑激酶（稀釋比為1∶1 000，Cell Signaling Technology公司）、整合素β1（稀釋比為1∶200，Santa Cruz Biotechnology公司），4℃過(guò)夜，漂洗，再加相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，洗膜，顯影曝光并成像，以GAPDH為內(nèi)參。通過(guò)Image J軟件分析灰度值，計(jì)算蛋白水平=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和率描述，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s描述，多組間相比用單因素方差分析，兩兩相比用HSD-q檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson法，診斷效能用ROC曲線法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同肝纖維化嚴(yán)重程度黏著斑激酶、整合素β1的表達(dá)比較

由表3可見(jiàn)，3組間黏著斑激酶的基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率和蛋白表達(dá)以及整合素β1的基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率和蛋白表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F黏著斑激酶=81.220、11.938和138.726，F(xiàn)整合素β1=103.906、35.852和318.706，P均<0.01）。

B組和C組黏著斑激酶基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率和蛋白表達(dá)以及整合素β1基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率和蛋白表達(dá)均高于A組（P均＜0.01），如圖1、圖2及表3所示。

圖2 不同分期肝纖維化患者肝組織中黏著斑激酶和整合素β1的免疫印跡圖

表3 不同分期肝纖維化患者黏著斑激酶和整合素β1的表達(dá)（x±s）

圖1 不同分期肝纖維化患者肝組織中黏著斑激酶和整合素β1免疫組化圖（蘇木素復(fù)染，×400）

二、相關(guān)性分析

研究組中黏著斑激酶的基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率、蛋白表達(dá)與患者纖維化分期均呈正相關(guān)（r=0.610、0.642和0.706，P均<0.01），整合素β1的基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率、蛋白表達(dá)也與患者肝纖維化分期呈正相關(guān)（r=0.520、0.498和0.596，P均<0.01）。

三、ROC分析

乙型肝炎肝纖維化患者肝組織中黏著斑激酶、整合素β1及二者聯(lián)合基因相對(duì)表達(dá)診斷的ROC曲線下面積分別為0.791、0.795和0.874；黏著斑激酶、整合素β1及二者聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)率診斷的ROC曲線下面積分別為0.895、0.827和0.926；肝組織中黏著斑激酶、整合素β1蛋白表達(dá)診斷的ROC曲線下面積分別為0.841、0.863和0.889，均具有一定的診斷價(jià)值，見(jiàn)表4及圖3。

圖3 肝組織中黏著斑激酶和整合素β1的基因表達(dá)、陽(yáng)性率表達(dá)和蛋白表達(dá)對(duì)乙型肝炎肝纖維化患者診斷的ROC曲線

表4 肝組織中黏著斑激酶、整合素β1對(duì)乙型肝炎肝纖維化患者的診斷效能

討 論

已有研究證實(shí)，HSC在肝損傷時(shí)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要生成細(xì)胞，因此HSC的活化和ECM的過(guò)量分泌是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[7-10]。黏著斑激酶是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，研究發(fā)現(xiàn)它可調(diào)控酪氨酸蛋白酶受體及整合素等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，該通路介導(dǎo)過(guò)程可作為HSC活化有關(guān)通路的交叉和樞紐[4-5，11]。整合素β1是一種跨膜糖蛋白受體分子，具有活化HSC及促進(jìn)ECM分泌的作用[12]。白瑞丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黏著斑激酶抑制劑能夠抑制HSC增殖，并促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而緩解肝纖維化進(jìn)程。林傳欽等[14]研究顯示，整合素β1阻斷可抑制黏著斑激酶的磷酸化，下調(diào)生長(zhǎng)因子及纖維化蛋白表達(dá)，進(jìn)而起到改善心肌細(xì)胞纖維化的作用。因此，作者推測(cè)黏著斑激酶和整合素β1可能參與乙型肝炎肝纖維化病情的發(fā)生發(fā)展，對(duì)該病的輔助檢測(cè)及診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，B組及C組黏著斑激酶和整合素β1的基因表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)率及蛋白表達(dá)均高于A組；且C組的相關(guān)表達(dá)高于B組，提示隨著患者肝纖維化病情嚴(yán)重程度的加劇，患者肝組織中黏著斑激酶、整合素β1表達(dá)呈明顯升高趨勢(shì)，推測(cè)兩者表達(dá)水平與乙型肝炎肝纖維化的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肝組織中黏著斑激酶、整合素β1表達(dá)與患者纖維化分期均呈正相關(guān)，證實(shí)肝纖維化進(jìn)展與黏著斑激酶、整合素β1表達(dá)變化密切相關(guān)。ROC分析結(jié)果顯示，肝組織中黏著斑激酶、整合素β1及二者聯(lián)合相對(duì)表達(dá)診斷乙型肝炎肝纖維化患者的ROC曲線下面積均大于0.7，且二者聯(lián)合相對(duì)表達(dá)對(duì)患者病情的診斷效果最優(yōu)，說(shuō)明黏著斑激酶與整合素β1聯(lián)合在輔助診斷乙型肝炎肝纖維化方面具有較高的診斷價(jià)值，對(duì)減少不必要的肝穿刺檢查具有重要意義。

綜上所述，黏著斑激酶和整合素β1在乙型肝炎肝纖維化患者中存在隨著病情程度加劇而升高的趨勢(shì)，且與患者肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為早期輔助診斷乙型肝炎肝纖維化的有效指標(biāo)，且二者聯(lián)合診斷效能相對(duì)較優(yōu)，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。由于本文為單中心研究，病例數(shù)量有限，今后將擴(kuò)大樣本數(shù)來(lái)驗(yàn)證以上結(jié)果。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突