吳 云 高曉艷 陳美玲 吳 翠

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 江蘇 連云港 222047

KY顆粒為中藥制劑,處方由黃芪、丹參、赤芍等六味中藥材所組成,方中黃芪為君藥,發(fā)揮補(bǔ)氣升陽(yáng),固表止汗的作用,由于該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有黃芪甲苷的含量測(cè)定項(xiàng)和赤芍、丹參兩個(gè)藥味的TLC鑒別項(xiàng),質(zhì)控指標(biāo)不能全面反映制劑質(zhì)量變化,其他藥味缺少質(zhì)控指標(biāo)。

隨著高效液相色譜技術(shù)（HPLC）和指紋圖譜技術(shù)在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,為了更全面的控制產(chǎn)品質(zhì)量一致性,通過(guò)分析中藥制劑的指標(biāo)性成分,研究并建立指紋圖譜或特征圖譜的方法,以達(dá)到控制中藥質(zhì)量的目的。本文擬建立KY顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜,更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和一致性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司,配有四元泵、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器等）;METTLER XSR304電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司,萬(wàn)分之一電子天平）;KQ-250DV超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111562-201917）;KY顆粒（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào)191001）;乙腈為色譜純;水為自制超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Welch Ultimate XB C18,250mm×4.6mm,5μm）;以乙腈為流動(dòng)相A,0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速為1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;柱溫為30℃。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

表1 流動(dòng)相洗脫比例

2.2 參照物溶液的制備 取丹酚酸B對(duì)照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成每1ml含丹酚酸B 60.25μg的對(duì)照品溶液,作為參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取KY顆粒約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25ml,密塞,超聲提取（功率250W,頻率40KHz）30min,濾過(guò),取續(xù)濾液,用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。

2.4 對(duì)照指紋圖譜的建立及共有峰的確定

取KY顆粒10批供試品,照2.3項(xiàng)的供試品溶液的制備方法,分別制備成供試品溶液,按2.1項(xiàng)的色譜條件,精密吸取參照物溶液、供試品溶液各10μl,注入高效液相色譜儀,測(cè)定。

從色譜軟件系統(tǒng)中導(dǎo)出圖譜,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）軟件,設(shè)置時(shí)間窗寬度0.1,多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配,生成對(duì)照指紋圖譜,見(jiàn)圖1。

圖1 KY顆粒對(duì)照指紋圖譜

根據(jù)色譜峰峰面積的大小,共確定12個(gè)指紋共有峰,不同批次間相同共有峰的紫外光譜基本一致,其中12號(hào)峰為丹酚酸B峰,設(shè)定為供試品指紋圖譜的參照峰（S峰）。10批供試品溶液的色譜圖具有對(duì)照指紋圖譜中的全部12個(gè)共有峰,且順序一致,相似度均大于0.90。

2.5 分析方法驗(yàn)證

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取KY顆粒191001供試品,照2.3項(xiàng)制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,以丹酚酸B峰（12號(hào)峰）作為參照峰,計(jì)算指紋圖譜中其他11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD和相對(duì)峰面積的RSD,結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.1%～1.0%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積的RSD均在0.5%～1.6%范圍內(nèi),均小于2.0%,表明該方法的精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取KY顆粒191001供試品6份,分別照2.3項(xiàng)制備6份供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖,計(jì)算各特征峰相對(duì)于丹酚酸B峰（12號(hào)峰）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD和相對(duì)峰面積的RSD,相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.4%～1.2%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積的RSD在0.9%～1.8%范圍內(nèi),均小于2.0%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取KY顆粒191001供試品,照2.3項(xiàng)制備供試品溶液,分別在0、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣,記錄色譜圖,以丹酚酸B峰（12號(hào)峰）作為參照物,計(jì)算指紋圖譜中各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD,相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.1%～0.7%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積的RSD在0.8%～1.8%范圍內(nèi),說(shuō)明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 供試品的相似度分析

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）軟件,以建立的對(duì)照指紋圖譜為參照?qǐng)D譜,導(dǎo)入10批KY顆粒的圖譜,時(shí)間窗寬度為0.1,多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配,計(jì)算10批供試品的相似度,結(jié)果10批KY顆粒的相似度均大于0.9,表明批間差異較小。

表2 KY顆粒10批供試品的相似度

3 討論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾考察了三根不同品牌的色譜柱,分別為Welch Ultimate XB C18、Kromasil 100-5 C18和 Agilent Eclipse plus C18,以分離度為考察標(biāo)準(zhǔn),在本文確定的流動(dòng)相比例下,使用Welch Ultimate XB C18色譜柱,各色譜峰分離度更優(yōu);在實(shí)驗(yàn)中選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),同時(shí)考察了220nm、270nm和321nm等多個(gè)波長(zhǎng),從整體性考慮,最終確定在220nm波長(zhǎng)下,色譜峰數(shù)量、大小均為最佳。