白莉圓，陳 雪，張 艷，徐 晨，孟勤燕，張永利，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406）

白酒（Baijiu）是一種蒸餾酒，與白蘭地、威士忌、伏特加、金酒和朗姆酒并稱為世界六大蒸餾酒[1]。白酒含有的主要成分為乙醇和水，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較少，僅占1 %～2 %，但對(duì)酒類的風(fēng)格、香氣、口感等品質(zhì)影響較大[2-4]。因其原料組成、生產(chǎn)工藝存在差異，使得白酒當(dāng)中的風(fēng)味物質(zhì)種類以及含量不同，從而造成白酒風(fēng)味的不同[5]，可分為清香型、醬香型、濃香型、米香型、鳳香型等12種香型[6]。西鳳酒作為鳳香型白酒的典型代表，以乙酸乙酯為主，己酸乙酯和高級(jí)醇為輔，具有醇香秀雅、諸味協(xié)調(diào)的特點(diǎn)[7]。

白酒中的風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)自于原料、酒醅發(fā)酵及蒸餾和陳放階段[8]，目前白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究主要是對(duì)各種香型成品酒、基礎(chǔ)酒和貯存酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類、含量及特征風(fēng)味物質(zhì)的研究[9-12]，對(duì)酒醅發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的研究相對(duì)較少。頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法是目前分析酒類中揮發(fā)性物質(zhì)的常用方法，范文來(lái)等[13]應(yīng)用固相微萃?。℉S-SPME）技術(shù)測(cè)定出固態(tài)發(fā)酵濃香型酒醅中包含106 種揮發(fā)性化合物；趙爽等[14]通過(guò)優(yōu)化HSSPME-GC-MS方法的萃取條件，分析檢測(cè)到不同時(shí)期酒醅中105種揮發(fā)性物質(zhì)；DONG[15]應(yīng)用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在整個(gè)麥芽發(fā)酵過(guò)程中，共檢測(cè)出47 種揮發(fā)性物質(zhì)；尚柯等[16]采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 對(duì)醬香白酒第三輪次堆積酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)與討論分析，共檢測(cè)出32種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

目前對(duì)鳳香型白酒酒醅的揮發(fā)性成分變化規(guī)律尚鮮有報(bào)道，本研究以西鳳酒圓窖時(shí)期的酒醅為研究對(duì)象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）結(jié)合主成分分析法（PCA），解析圓窖期不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，為研究酒醅中特色風(fēng)味物質(zhì)及西鳳酒的發(fā)酵機(jī)理提供依據(jù)，對(duì)西鳳酒優(yōu)化工藝、提升品質(zhì)、增加效益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

酒醅樣品：取自陜西西鳳酒股份有限公司903制酒車間圓窖期重點(diǎn)窖酒醅。

酒醅取樣方法：分別按入池0 d、4 d、7 d、10 d、14 d、18 d、22 d 和30 d（出池）時(shí)間跟蹤取樣8 次。使用取樣器取樣，取樣時(shí)選擇上、中、下層分別取樣，注意避開窖池靠窖池壁處，選擇中部略靠窖池壁處，然后將三層的樣品混合均勻后，分裝成3 份，置于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

丙酸辛酯、L-薄荷醇、氯化鈉等。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、固相微萃取頭、固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣器（MPS 2）、超聲水浴清洗儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理

取酒醅25 g，用50 mL 超純水混勻后，于冰水浴超聲30 min，4 ℃下以10000 r/min 離心20 min。取上清液8 mL 置于20 mL 頂空瓶中，加入3 g 氯化鈉飽和。再加入10 μL 混合內(nèi)標(biāo)（L-薄荷醇，終濃度為125.41 μg/L），密封后進(jìn)行下一步萃取。

1.2.2 頂空固相微萃取條件

三相萃取頭（DVB/CAR/PDMS，50/30 μm），將萃取頭插入至萃取瓶上部的空氣部分（注意不能觸及液面），50 ℃預(yù)熱5 min，吸附萃取45 min，將萃取頭插入儀器的進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min，同時(shí)儀器啟動(dòng)進(jìn)行樣品分析。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：DB-FFAP（60 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱。升溫程序：50 ℃保持2 min，4 ℃/min升溫至230 ℃，保持15 min。進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250 ℃；載氣為He，流速2 mL/min。

1.2.4 質(zhì)譜條件

EI 電離源；離子源溫度：230 ℃；電子轟擊能量：70 eV；掃描范圍：35～350 amu。

1.2.5 定性和定量

定性：將酒醅提取液中的微量成分與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，再對(duì)比未知化合物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在NIST 05 a.L 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)離子碎片圖，直接添加標(biāo)準(zhǔn)品離子圖譜等方法來(lái)確認(rèn)檢測(cè)到風(fēng)味化合物，對(duì)酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)定性。

定量：對(duì)各風(fēng)味物質(zhì)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量，利用選擇特征離子方法計(jì)算各風(fēng)味物質(zhì)的峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立是以各風(fēng)味物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物面積之比為橫坐標(biāo)，兩者濃度之比為縱坐標(biāo)。

每個(gè)酒醅樣取3 份樣品，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成

由表1 可知，不同發(fā)酵時(shí)間檢測(cè)的揮發(fā)性化合物的種類及含量均存在差異。利用HS-SPMEGC-MS 技術(shù)，在西鳳酒酒醅中共檢測(cè)到33 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類7 種（除乙醇）、酸類7 種、酯類13種、酮類4種、醛類1種、酚類1種。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅的揮發(fā)性成分及含量 （μg/kg）

由表2 可知，0 d 的酒醅中共檢測(cè)出19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要是酯類與酸類；發(fā)酵至4 d 時(shí)總計(jì)檢出25 種化合物，醇類物質(zhì)種類增加，檢測(cè)出4 種酮類化合物；發(fā)酵至7 d 時(shí)，酯類物質(zhì)增加至12 種，檢測(cè)出1 種酚類物質(zhì)，此時(shí)檢測(cè)出23 種化合物；發(fā)酵至22 d 時(shí)，檢測(cè)出23 種化合物，其中主要是酯類、醇類和酸類化合物；發(fā)酵至30 d 時(shí)，共檢測(cè)出20種化合物。在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，酒醅中均檢測(cè)出了醇類、酸類和酯類化合物，由此可見這三類化合物對(duì)鳳香型白酒的獨(dú)特風(fēng)味具有重要影響。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅的揮發(fā)性化合物數(shù)量統(tǒng)計(jì)(種)

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中各類風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律（圖1）

圖1 酒醅發(fā)酵過(guò)程中各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化

醇類化合物是白酒香氣成分中重要的一類物質(zhì)，其突出的特點(diǎn)是沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，起到“助香”作用[17]，少量的高級(jí)醇可以襯托酯香，使酒體醇甜、香氣更豐滿[18]。由圖1 可以看出，醇類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中波動(dòng)變化，由發(fā)酵開始的0.62 mg/kg 增加至結(jié)束時(shí)的2.35 mg/kg，增加了近3 倍。異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇在酒醅發(fā)酵過(guò)程中含量較高，占醇類物質(zhì)總量的87.0 %，其中又以異戊醇含量最多，具有白蘭地香氣和辛辣味[19]。

酸類化合物是白酒中重要的呈味物質(zhì)，具有協(xié)調(diào)口感、平衡酒味的作用，可以使酒的香氣更加柔和飽滿[8]。由圖1 可知，酸類物質(zhì)在發(fā)酵第0～11 d增加至最大值12.31 mg/kg，之后有所下降后趨于平穩(wěn)。乙酸、己酸、丁酸在酒醅發(fā)酵過(guò)程中含量最多，占酸類物質(zhì)總量的97.5 %，它們?cè)诎l(fā)酵前期增加，中后期下降，可能是由于酸類物質(zhì)和乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，生成了相應(yīng)的酯類風(fēng)味物質(zhì)。

酯類化合物是白酒中含量最多的一類風(fēng)味成分，賦予白酒果香和花香[20]，是西鳳酒酒醅檢測(cè)出的種類最多的風(fēng)味物質(zhì)，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、棕櫚酸乙酯等。酯類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中不斷積累，在發(fā)酵22 d 時(shí)達(dá)到峰值，從發(fā)酵開始時(shí)的15.05 mg/kg 增大至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的50.20 mg/kg，增加了35.15 mg/kg，是發(fā)酵開始的3.3 倍。乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯在酒醅發(fā)酵過(guò)程中含量最多，占酯類物質(zhì)的95.9 %，具有水果香，是鳳香型白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)。綜合來(lái)看，醇類、酸類、酯類化合物含量的變化情況相似，均是在0～11 d 期間增加，15 d 時(shí)下降后又緩慢上升，在30 d 時(shí)下降。在西鳳酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中，酯類物質(zhì)含量最高，其次是酸類、醇類物質(zhì)，酮類、醛類、酚類物質(zhì)的種類和含量均較低，以上風(fēng)味物質(zhì)的種類與含量，形成了西鳳酒醇香秀雅、甘潤(rùn)挺爽、諸味協(xié)調(diào)的典型風(fēng)格。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中四大酯變化規(guī)律（圖2）

圖2 酒醅發(fā)酵過(guò)程中四大酯含量變化

隨著發(fā)酵的進(jìn)行四大酯變化規(guī)律如圖2。由圖2 可知，乙酸乙酯含量最高，帶有果香和酒香，在發(fā)酵過(guò)程中波動(dòng)上升，從發(fā)酵開始時(shí)的9.6 mg/kg 增加至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的25.18 mg/kg，增加了1.6倍，在發(fā)酵22 d 時(shí)達(dá)到最大值44.3 mg/kg。乳酸乙酯在發(fā)酵0～22 d 期間其含量一直增加，在22 d 時(shí)達(dá)到最大值28.55 mg/kg，此后略有下降，這是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌成為主要優(yōu)勢(shì)菌，酒醅中積累了大量的乳酸和乙醇，使乳酸乙酯大量而快速生成。己酸乙酯在發(fā)酵過(guò)程中先上升后大幅下降，然后緩慢上升，在30 d時(shí)略有下降，從發(fā)酵開始時(shí)的2.4 mg/kg增加至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的5.54 mg/kg，在發(fā)酵11 d 時(shí)達(dá)到最大值21.34 mg/kg。丁酸乙酯含量較低，變化趨勢(shì)與己酸乙酯相似，其含量從發(fā)酵0 d 時(shí)的1.54 μg/kg增加至發(fā)酵30 d時(shí)的2.68 μg/kg。

2.4 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析（表3）

表3 主成分特征值及其貢獻(xiàn)率

由表3 可以看出，利用主成分分析法共提取了2 個(gè)主成分，其中第1 主成分（PC1）的特征值大于1，方差貢獻(xiàn)率為49.1 %；第2 主成分（PC2）的特征值大于1，方差貢獻(xiàn)率為33.5%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到82.5%（＞80%），表明這2 個(gè)主因子能代表8 個(gè)酒醅樣品中33 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)82.5 %的信息，因此可以選擇這2個(gè)主因子進(jìn)行分析。

在主成分分析中，載荷因子可以反映不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，絕對(duì)值越大表明該變量的影響越大。由表4 可知，第1 主成分（PC1）相比于第2 主成分（PC2）在異丁醇、正丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、乙酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、9-十八烯酸乙酯、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯、乙縮醛上有較高的載荷系數(shù)，說(shuō)明主成分1（PC1）與這些變量有很高的相關(guān)性；第2主成分（PC2）在丁酸、戊酸、己酸、辛酸、己酸甲酯、庚酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚上載荷值較大，即這些物質(zhì)對(duì)主成分2 體現(xiàn)的風(fēng)味信息起主要作用。

表4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分載荷矩陣

以主成分1（PC1）為橫坐標(biāo)，主成分2（PC2）為縱坐標(biāo)，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3 和圖4。圖3 為8 個(gè)酒醅樣品在主成分1 和主成分2 上的得分分布，圖4 為酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在主成分1和主成分2上的分布。

圖3 酒醅樣品主成分分析

圖4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

由圖3 可知，0 d、4 d、7 d、15 d、30 d、18 d 酒醅樣品整體較為集中，除0 d 外均在x 軸下方，y 軸附近，表明這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較為相似；0 d 樣品在第2 象限，位于x 軸上方，離x 軸較近；11 d、22 d 樣品分別位于第1、第4 象限，與其他樣品距離較遠(yuǎn)，完全分開，說(shuō)明這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分最為不同。

結(jié)合圖3 和圖4 可知，0 d 酒醅樣品落在第2 象限，以辛酸為特征風(fēng)味物質(zhì)，具有水果香；11 d 酒醅樣品位于第1 象限，與己酸甲酯、己酸、戊酸、丁酸、

庚酸乙酯、2,3-丁二醇、戊酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、己酸乙酯相對(duì)應(yīng)；18 d、22 d 樣品位于第4 象限，結(jié)合表1 可知，18 d 樣品以苯乙醇為特征物質(zhì)，22 d樣品主要與乙縮醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁醇、乙酸、乙酸丁酯、乳酸乙酯、9-十八烯酸乙酯、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯相對(duì)應(yīng)。由表1 可知，4 d、7 d、15 d、30 d 酒醅樣品中雖沒(méi)有特征物質(zhì)，但也含有豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析（圖5）

圖5 酒醅樣品聚類分析

依據(jù)酒醅發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖5。8 個(gè)樣品被分為4類，0 d、4 d、7 d 分為一類，18 d、15 d、30 d 分為一類，11 d 和22 d 分別為一類，表明各分類下的酒醅中風(fēng)味物質(zhì)組成相關(guān)性高。依據(jù)分析結(jié)果，發(fā)酵大體可分為兩類，發(fā)酵前期0～10 d、發(fā)酵中后期11～30 d。

3 結(jié)論與展望

利用HS-SPME-GC-MS 法測(cè)定西鳳酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，共檢測(cè)到33 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類7 種（除乙醇）、酸類7 種、酯類13種、酮類4種、醛類1種、酚類1種，酯類物質(zhì)含量最高，其次是酸類、醇類物質(zhì)。異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇占醇類物質(zhì)總量的87.0 %，乙酸、己酸、丁酸占酸類物質(zhì)總量的97.5%，乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯占酯類物質(zhì)的95.9 %，乙酸乙酯含量最高，從發(fā)酵開始時(shí)的9.6 mg/kg 增加至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的25.18 mg/kg，增加了1.6倍。

對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，選擇前2個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)82.5 %。結(jié)果表明，0 d、4 d、7 d、15 d、18 d、30 d 酒醅樣品整體較為集中，11 d和22 d的酒醅樣品最為不同，分別包含了10種、13 種特征風(fēng)味物質(zhì)。依據(jù)聚類分析結(jié)果，將發(fā)酵分為兩類，發(fā)酵前期0～10 d、發(fā)酵中后期11～30 d。但此研究?jī)H選取了西鳳酒一個(gè)生產(chǎn)周期內(nèi)6個(gè)生產(chǎn)階段的其中1 個(gè)階段的酒醅樣品進(jìn)行分析，還需對(duì)西鳳酒每個(gè)生產(chǎn)階段的酒醅中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行探究，才可挖掘出西鳳酒酒醅中特色風(fēng)味物質(zhì)，為探究西鳳酒的發(fā)酵機(jī)理提供依據(jù)。