羅 莉，黃啟林，譚愛華，李方橋，孫 智

(1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，湖北宜昌 443003；2.宜昌市裕禾菌業(yè)有限公司，湖北宜昌 443003)

紅曲霉是中國傳統(tǒng)食品發(fā)酵中重要的微生物，尤其是在傳統(tǒng)發(fā)酵領(lǐng)域和食品配料領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。首先紅曲霉可以產(chǎn)生諸如糖化酶、酯化酶、蛋白酶等酶制劑，因此可以被應(yīng)用于釀造、蛋白制品發(fā)酵等領(lǐng)域，作為原料降解、風(fēng)味物質(zhì)合成等多用途[1-2]。另外紅曲霉的兩大類次級(jí)代謝產(chǎn)物也被廣泛的應(yīng)用，紅曲色素是目前使用歷史最長、應(yīng)用體量最大、使用范圍最為廣泛的一類紅曲霉代謝產(chǎn)物，其應(yīng)用已有上千年歷史，獨(dú)特的天然色素屬性一直受到食品行業(yè)青睞[3]。另一大類紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物是近幾年研究比較多的健康功能因子，如具有降血脂功能的莫納克林K 以及具有調(diào)節(jié)身體功能的γ-氨基丁酸類[4-5]。紅曲霉健康功能因子在亞洲有較早的認(rèn)知和應(yīng)用歷史，近些年也正逐步被歐美國家接受[6]。

目前國內(nèi)和紅曲相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)共有4 個(gè)[7]，其中真正和紅曲霉相關(guān)的為GB 1886.19—2015《食品添加劑紅曲米》，其他都與紅曲色素相關(guān)。作為紅曲米生產(chǎn)單位，在國標(biāo)限制范圍內(nèi)，紅曲霉只能采用大米作為培養(yǎng)原料，所以紅曲霉的培養(yǎng)至關(guān)重要[8]。本研究以工業(yè)紅曲米生產(chǎn)為背景，探索色素型紅曲霉工業(yè)生產(chǎn)碳源、氮源，優(yōu)化培養(yǎng)工藝，以期為紅曲霉的工業(yè)化生產(chǎn)原材料選擇做一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

菌種：紅曲霉Q，實(shí)驗(yàn)室菌種。

原材料：葡萄糖、秈米、黃豆餅粉、玉米粉、玉米淀粉、米粉均采購自宜昌當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

試劑及耗材：酵母浸出物FN502，安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，硝酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種斜面培養(yǎng)基（加強(qiáng)型PDA 培養(yǎng)基）：PDA培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯200，葡萄糖18，硫酸鎂5，磷酸二氫鉀5，瓊脂粉20。

液體種培養(yǎng)基（g/L）：碳源30（葡萄糖、蔗糖、淀粉、米粉、玉米粉、固態(tài)麥精）、氮源3（酵母浸出物、硝酸鈉、蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、氯化銨）、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.5。

1.1.3 儀器設(shè)備

ZXMP-A1430 恒溫恒濕培養(yǎng)箱；BSC-1300ⅡB2 無菌操作臺(tái)UV5200 分光光度計(jì)；ZQZY-85CN恒溫?fù)u床。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)工藝

本試驗(yàn)采用工藝流程：斜面菌株→茄子瓶（孢子懸濁液）→液體一級(jí)種→米飯（接種）→淺盤→翻料→培養(yǎng)

1.2.2 孢子懸濁液制備

茄子瓶中，采用紅曲霉菌種斜面培養(yǎng)基制備，劃線接種。在33 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，后采用60 mL無菌水洗脫，備用。

1.2.3 一級(jí)種子制備

將1.2.2 中的孢子懸濁液按照培養(yǎng)體積的3 %進(jìn)行添加，在搖床200 r/min，33 ℃條件下，培養(yǎng)48 h后檢測色價(jià)并備用。

在碳源考察中，氮源采用酵母浸出物，當(dāng)完成碳源考察后，固定效果最佳碳源，考察氮源。

1.2.4 培養(yǎng)及檢測

將秈米浸泡12 h 后，瀝干水分，上汽蒸30 min后，攤晾。將培養(yǎng)好的種子液用無菌酸化水pH3.5稀釋5 倍，分別按照15%接種米飯攪拌均勻，33 ℃培養(yǎng)，每天觀察水分含量進(jìn)行翻料補(bǔ)水，米飯維持水分40%～45%，培養(yǎng)10 d 后，50 ℃慢速干燥、粉碎80～100 目、檢測色價(jià)。檢測方法參照GB 1886.19—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲米》進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源的種子液色價(jià)發(fā)酵結(jié)果

在不同碳源條件下，種子液發(fā)酵48 h 后色價(jià)出現(xiàn)了顯著的變化，如圖1 所示，在幾種碳源條件下，發(fā)現(xiàn)單糖和二糖類在其中對紅曲霉色素的代謝沒有顯著促進(jìn)作用，另外還有一個(gè)明顯的差異，就是在淀粉上面，玉米淀粉與米粉都顯示出了非常好的效果，在這點(diǎn)上何冬萍等[9]采用葛根粉在液態(tài)紅曲霉培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)葛根粉與米粉的差異不大，說明此類淀粉都可以很好的促進(jìn)紅曲霉色素代謝積累。整體效果上，玉米粉與玉米淀粉的差異，我們認(rèn)為主要在顆粒度上有差異，導(dǎo)致實(shí)際培養(yǎng)體系中菌體接觸面以及溶解性都會(huì)影響到紅曲霉后續(xù)的產(chǎn)色素能力。鑒于玉米淀粉與米粉效果接近，考慮到工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用成本因素，后續(xù)對氮源的考察采用玉米淀粉作為固定碳源。

圖1 不同碳源條件下發(fā)酵48 h色價(jià)變化

2.2 不同氮源的種子液色價(jià)發(fā)酵結(jié)果

圖2 的結(jié)果是在以玉米淀粉為碳源條件下，對氮源進(jìn)行了考察，為了避免上面的影響，我們將碳源減少為之前比例的30 %進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有如下特點(diǎn)。在碳源減少條件下，酵母浸出物在發(fā)酵過程中對色素的積累的影響是最低的，而無機(jī)氮，尤其是硝酸氮的表現(xiàn)是最佳的。這點(diǎn)與相關(guān)研究是吻合的[10]，無機(jī)氮在紅曲霉色素積累方面更有優(yōu)勢，另外，在一些文獻(xiàn)報(bào)道里面，銨鹽在生物量上有一定的優(yōu)勢，在本次研究中，沒有以生物量作為核心指標(biāo)，而是將色價(jià)作為評價(jià)指標(biāo)，本次研究中顯示硝酸鈉對于紅曲霉色素的積累有促進(jìn)作用。

圖2 不同氮源條件下發(fā)酵48 h色價(jià)變化

2.3 碳源氮源配比研究

在上面兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，由于3%的碳源已顯示出比較好的效果，后面我們固定碳源水平，對硝酸鈉的添加量做了梯度添加，并將培養(yǎng)好的種子液接入米飯中培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同碳氮比下的種子培養(yǎng)色價(jià)和終產(chǎn)品色價(jià)

最終的結(jié)果可以清晰的顯示，在碳源固定后，加入硝酸鈉的量對于種子的色素積累同樣有一定的影響。結(jié)果表明，如果種子液的色價(jià)情況好，最終紅曲米的色價(jià)積累情況也好，在本次實(shí)驗(yàn)中，種子液色價(jià)和最終紅曲米的色價(jià)有一定正相關(guān)性，且硝酸鈉的最佳添加范圍在培養(yǎng)基的0.2%～0.4%。

3 結(jié)論

紅曲霉（紅曲米）的生產(chǎn)需要從效率以及成本多方面考慮，本文從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)玉米淀粉與硝酸鈉均有較好的紅曲霉色素積累功效，在紅曲霉生長過程中，二者的添加對于紅曲霉的色素積累有一定的疊加作用，另外從另一個(gè)角度發(fā)現(xiàn)，種子液的色價(jià)與最終產(chǎn)品色價(jià)有一定的正相關(guān)性。結(jié)果顯示，當(dāng)最終種子液采用3%玉米淀粉與0.2 %～0.4 %的硝酸鈉時(shí)，種子液的色價(jià)積累較好，且在最終紅曲米的接種和最終生產(chǎn)結(jié)果上，可以達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量要求。

中國是世界上紅曲霉相關(guān)產(chǎn)品最大的生產(chǎn)國和消費(fèi)國，而紅曲米的生產(chǎn)目前整體條件參差不齊[11]，與現(xiàn)有工業(yè)微生物生產(chǎn)模式相比，紅曲米的生產(chǎn)還存在單批產(chǎn)量小、微生物控制難度大、產(chǎn)品質(zhì)量波動(dòng)大的問題，在現(xiàn)有條件下，進(jìn)一步提升紅曲霉類產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝及其配套條件是行業(yè)需要共同關(guān)注的問題。除了基礎(chǔ)食品工業(yè)外，紅曲霉的功能特性已經(jīng)成為近些年的研究熱點(diǎn)，為紅曲霉工業(yè)的進(jìn)一步提升創(chuàng)造了很好的條件。