班振英，蔡欣桐，智艷芳，張威，杜艷敏，李珍，劉麗萍

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

0 引言

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來早期宮頸癌篩查使患者生存率明顯提高，但研究顯示，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移仍是宮頸癌患者死亡的重要原因，嚴重威脅女性健康[1,2]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)是上皮源性細胞的形態(tài)改變、極性消失、細胞間連接減弱、間隙增大等使其獲得間質(zhì)型細胞特征的細胞變化過程，EMT的發(fā)生已被證實是惡性腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移的重要原因[3,4]。EMT過程涉及一些標志蛋白如E-cadherin，N-cadherin，vimentin，slug，snail，Twist，ZEB等的表達變化。其中E鈣粘蛋白(E-cadherin)是Ca2+依賴性上皮源性蛋白，在EMT過程中通常表達降低[5]。波形蛋白(vimentin)是間質(zhì)源性Ⅲ型中間纖維(IFs)蛋白之一，其在腫瘤中表達增加被認為是EMT的重要標志[6]。

促紅素人肝細胞受體A2(erythropietin-producinghuman hepatocellular,EphA2)是Lindberg等人發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸激酶活性的Eph亞家族成員之一，由976個氨基酸構(gòu)成的多肽, 主要表達于細胞-細胞連接處，作用于細胞生長、遷移等過程[7]。近年來多項研究表明，EphA2在參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展時其表達與EMT過程密切相關(guān)，可以促進腫瘤細胞增殖，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8,9]。但在宮頸癌中EphA2與EMT的相關(guān)研究較少。本實驗旨在研究EphA2在宮頸癌組織中的表達情況及與EMT過程中E-cadherin，vimentin表達的相關(guān)性，以期為早期預防宮頸癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移和基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年至2020年經(jīng)我院確診并手術(shù)切除的宮頸組織117例，其中正常宮頸組織30例，HSIL組織30例，宮頸鱗癌組織57例(其中不伴轉(zhuǎn)移37例，伴轉(zhuǎn)移20例)。收集患者臨床病理資料包括：年齡，組織學分級，肌層浸潤深度，分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有病例均為原發(fā)性腫瘤，初次手術(shù)治療，手術(shù)前未行放、化療治療，不合并心腦血管腎等嚴重內(nèi)科疾病。

1.2 方法

1.2.1 制備組織芯片

術(shù)中切除組織標本經(jīng)10%的中性福爾馬林固定后石蠟包埋，切取厚度4μm做HE染色，由兩名臨床經(jīng)驗豐富的副高職稱以上病理科醫(yī)師閱讀切片，標記癌變組織部位，于對應蠟塊上用打孔器取大小約1cm×1cm×2mm蠟塊組織編號并記錄臨床病理資料。另取大小4cm×2cm×1cm空白蠟塊，用注射器針頭劃網(wǎng)格狀，在每個網(wǎng)格交叉點處用打孔器取1cm×1cm×2mm大小蠟塊制成模塊，將已編號的蠟塊組織依次放入陣列模塊中。溫箱中加熱使所有編號組織與陣列模塊融為一體。冷卻后切取厚度4μm薄片，80℃烤箱2h。采用二甲苯脫蠟后，梯度酒精水化，熱修復法修復抗原。

1.2.2 免疫組織化學SP法

檢測組織芯片上EphA2、E-cadherin、vimentin的表達。每張芯片重復實驗三次?？乖迯途彌_液(基因科技上海股份有限公司貨號GT100410批號2019121601)，EphA2購于(Cell Signaling Technology,貨號#6997)，非特異性染色抗原阻斷劑(基因科技上海股份有限公司貨號GK600511-A批號2019072301)酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(基因科技上海股份有限公司貨號GK600511-B批號2019072301)，DAB染色液(基因科技上海股份有限公司貨號GK600511批號2019072301)具體過程參照說明書。根據(jù)說明書陰性對照為PBS液代替一抗；陽性對照為卵巢癌組織。

1.2.3 免疫組化結(jié)果的判讀

每張切片隨機觀察5個高倍視野，根據(jù)陽性細胞比例計數(shù)：陽性細胞占總細胞數(shù)<10%--0分；10%～25%--1分；26%～50%--2分；51%～75%--3分；>75%--4分。染色深度評分：無染色—0分；淡黃色—1分；黃色～棕黃色—2分；棕褐色—3分?？傇u分=陽性細胞數(shù)評分×染色深度評分。總評分0分—陰性(-)；1～4分—弱陽性(+)；5～8分—陽性(++)；9～12分—強陽性(+++)。陰性與弱陽性為低表達，陽性與強陽性為高表達[10]。三次重復實驗后評分取平均值。

1.2.4 Western Blot檢 測EphA2、E-cadherin、vimentin蛋白表達

隨機選取正常組、HSIL組、宮頸癌組組織，每組6例，液氮凍存，經(jīng)RIPA組織蛋白裂解液裂解、研磨、超聲破碎。使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取 30μg蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳，分別加入兔抗人多克隆抗體(PBS稀釋1∶20000)，孵育過夜，加入辣根酶標記的二抗孵育，ECL化學發(fā)光、顯影，Image J 軟件分析灰度，以β-actin為內(nèi)參 (PBS稀釋1∶2 000)，目標蛋白灰度值和內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析。

應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料之間比較采用χ2檢驗，計量資料以(±s)表示，計量資料采用t檢驗，相關(guān)性分析采用spearson相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EphA2、E-cadherin、vimentin在正常組、HSIL組、宮頸鱗癌組中的表達情況

EphA2主要表達于細胞質(zhì)和細胞膜，E-cadherin主要表達于細胞膜，vimentin主要表達于細胞質(zhì)。三者在宮頸癌組中的表達與正常組及HSIL組均有明顯差異，如表1所示(P<0.05)。其中宮頸鱗癌組中的EphA2、E-cadherin、vimentin的陽性表達率分別為 64.91%(37/57),29.82%(17/57), 57.89%(33/57)。

圖1 不同宮頸組織中EphA2的表達(SP法，×200)A:正常宮頸組；B:HSIL組；C:宮頸鱗癌組

圖2 不同宮頸組織中E-cadherin的表達(SP法，×200) A:正常宮頸組織中E-cadherin在細胞膜上陽性表達；B：HSIL組織中E-cadherin表達減弱；C:宮頸鱗癌組織中E-cadherin表達陰性

圖3 不同宮頸組織中Vimentin的表達(SP法，×200)A:正常宮頸組；B:HSIL組；C:宮頸鱗癌組

2.2 EphA2、E-cadherin、vimentin在宮頸癌組織中的表達及其與臨床病理因素的關(guān)系

如表2所示，宮頸癌組織中EphA2在伴有深肌層浸潤(>2/3纖維肌層)宮頸癌組織中表達明顯高于無深肌層浸潤的組織(χ2=7.822，P<0.01)，在伴有淋巴轉(zhuǎn)移組中的表達較無轉(zhuǎn)移組中表達有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.459，P<0.05)。與年齡、FIGO分期、分化程度、腫瘤大小、組織學分型差異均無統(tǒng)計學意義。

表2 EphA2在宮頸癌中的表達與臨床病理特征的關(guān)系(n,%)

E-cadherin在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達較無轉(zhuǎn)移組中表達有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.786，P<0.05)，在伴有肌層浸潤的宮頸癌組織中的表達較無肌層浸潤組織中的表達明顯降低(χ2=5.116，P<0.05),與年齡、分化程度、腫瘤大小差異均無統(tǒng)計學意義。

vimentin在伴有肌層浸潤宮頸癌組織中表達明顯高于無肌層浸潤的組織(χ2=3.898，P<0.05)在伴有淋巴轉(zhuǎn)移組中的表達較無轉(zhuǎn)移組中表達有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.286，P<0.01)，與年齡、分化程度、腫瘤大小差異均無統(tǒng)計學意義。

2.3 EphA2與E-cadherin、vimentin在宮頸癌組織中表達的相關(guān)性分析

在 宮 頸 癌 組 織 中，EphA2，vimentin表 達 升 高，而E-cadherin表達明顯降低。采用Spearman’s秩相關(guān)性分析，如表3所示，宮頸癌中EphA2的表達與vimentin陽性表達呈正相關(guān)(r=0.490，P<0.01)；與E-cadherin表達呈負相關(guān)(r=-0.324，P<0.05)。

表3 宮頸癌組織中EphA2、E-cadherin、vimentin表達的相關(guān)性分析

2.4 Western Blot 檢測結(jié)果

如圖4所示，EphA2在正常宮頸組，HSIL組，宮頸癌組中的表達依次升高，與正常宮頸組相比，宮頸癌組中表達增高(P<0.05)差異有統(tǒng)計學意義。E-cadherin在三組組中的表達依次降低。Vimentin在三組中表達依次升高，且在宮頸癌組中的表達明顯高于正常宮頸組及HSIL組(P<0.05)。

圖4 Western blot 法檢測EphA2、E-cadherin、vimentin的蛋白表達

3 討論

EphA2主要表達于成人上皮細胞的細胞-細胞連接處，細胞生長、遷移及血管生成等過程[11]。研究發(fā)現(xiàn)激活cAMP/PKA通路可調(diào)節(jié)EphA2表達的同時對EMT標志物E-cadherin同樣具有調(diào)節(jié)作用[12]。在腫瘤發(fā)展中，EMT過程涉及另一重要信號通路為Wnt /β-catenin信號通路[13]。在胃癌中，針對EphA2的調(diào)控因子miR-302B，可通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖，并通過調(diào)節(jié)EphA2產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)，減弱N-鈣粘蛋白的表達及Wnt/β-catenin/EMT信號通路的功能來抑制胃癌細胞的上皮轉(zhuǎn)移[9]。在另一項研究中也同樣證實，EphA2可通過Wnt/β-catenin信號通路促進EMT的發(fā)展[14]。

本研究發(fā)現(xiàn) EphA2 與患者年齡、病理類型，腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，但在不同的浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達均有顯著性關(guān)系(P<0.05)，且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，EphA2 的表達隨之增高，因此 EphA2 的高表達可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)；

E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是Ⅰ型鈣粘蛋白的原型。有關(guān)食管癌的最新研究表明，通過沉默G3BP1觀察到Wnt/β-catenin和PI3K/Akt的表達水平下調(diào)，E-cadherin顯著升高，抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。在肝癌組織中，Ras相關(guān)家族成員Rab23，通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF -β)激活Rac途徑，促進N-鈣粘蛋白及vimentin表達，降低E-cadherin的表達，促進EMT過程及腫瘤細胞的遷移擴散[16]。在非小細胞肺癌的EMT過程中，通過Ras/ERK/Snail1途徑的激活，使E-cadherin表達降低[17]。在宮頸癌細胞中研究表明E-cadherin表達受氯化鉀共轉(zhuǎn)運蛋白3(KCC3)負性調(diào)節(jié)，過表達的KCC3通過抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄并加速蛋白體依賴性β-catenin的蛋白降解而抑制E-cadherin /β-catenin復合物的形成，從而減弱細胞間聯(lián)系，增強腫瘤細胞的侵襲性和增殖能力，促進EMT刺激腫瘤進展[18]。

F-波形蛋白(Vimentin)屬Ⅲ型中間絲蛋白，與微管、微絲共同構(gòu)成維持細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的細胞蛋白骨架。作為EMT過程中經(jīng)典的間質(zhì)細胞型標志物，vimentin在多種腫瘤中表達升高，如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌[19-21]等，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在有關(guān)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-21協(xié)同轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，激活Rac通路上調(diào)vimentin的表達，促進EMT過程及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。同時，在宮頸癌中也觀察到，miR-21過表達促進鋅指E盒結(jié)合同源盒(ZEB1，為E-cadherin的阻遏物)和vimentin的表達升高，促進EMT進程及腫瘤轉(zhuǎn)移[22]，但具體機制有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)EphA2在宮頸癌中陽性表達增高的同時出現(xiàn)E-cadherin蛋白的表達下降和vimentin蛋白的表達升高的現(xiàn)象。我們對EphA2、E-cadherin蛋白、vimentin蛋白表達之間的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌中EphA2的表達與E-cadherin蛋白的表達呈負相關(guān)；與vimentin蛋白的表達呈正相關(guān)。侯福濤等[23]在胃癌中的研究也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)論.這些研究均表明EphA2與EMT之間可能存在著某些潛在的聯(lián)系，提示EphA2可能通過參與 EMT的過程從而在宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但其具體作用機制仍不清楚。EphA2有望成為宮頸癌診斷與治療的新的潛在靶標，但仍需進一步實驗證實。