方振峰，房 輝，王 峰

?化學(xué)成分 ?

越南安息香中1個新的苯丙素類化合物

方振峰1，房 輝1，王 峰2, 3

1. 江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，湖北 武漢 430056 2. 國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006 3. 廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

研究越南安息香（白花樹的干燥樹脂）的化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性。采用MCI gel CHP-20P、硅膠、Sephadex LH-20柱色譜、快速制備色譜和制備HPLC等技術(shù)進(jìn)行分離和純化，通過IR、1D-和2D-NMR、HR-ESI-MS 等譜學(xué)數(shù)據(jù)分析確定化合物的結(jié)構(gòu)。通過CCK-8法評價(jià)了化合物的細(xì)胞毒性。從越南安息香提取物中分離得到6個化合物，分別鑒定為()-3-[3-甲氧基-4-(3-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯基]烯丙基苯甲酸酯（1）、2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-(3-羥丙基)-7-甲氧基苯并呋喃（2）、(＋)-雪松素（3）、(＋)-松脂素（4）、松脂素單甲醚（5）和安息香脂素（6）。以上6個化合物對人宮頸癌HeLa細(xì)胞株、人肝癌HepG-2細(xì)胞株、人乳腺癌MCF細(xì)胞株、人前列腺癌PC-3細(xì)胞株以及人肺癌A549細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度值均大于100mmol/L?；衔?為未見報(bào)道的新苯丙素類化合物，命名為白花樹酯醚，化合物2～6為首次從越南安息香中分離得到?；衔?～6均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性。

安息香屬；越南安息香；苯丙素類化合物；白花樹酯醚；細(xì)胞毒性；(＋)-松脂素；安息香脂素

越南安息香為安息香科安息香屬植物白花樹(Pierre) Craib ex Hartw的干燥樹脂[1]，白花樹是一種熱帶及亞熱帶樹種，在我國主要分布于云南、貴州、廣西、廣東、福建、湖南和江西等省[2]。安息香在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中常將其用于治療中風(fēng)痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、心腹疼痛等臨床癥狀[3]。目前，在安息香多種藥用來源中，應(yīng)用最廣的為來源于印度尼西亞蘇門答臘安息香和來源于越南、老撾、泰國等地的安息香[4]，在國內(nèi)所使用的安息香主要來源于后者。目前，從越南安息香中分離得到的化合物主要集中在三萜類和苯丙素類化合物，其中三萜類化合物約有11個[5-7]，苯丙素類化合物約有13個[4,6,8-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，安息香具有抗腫瘤[5,8,11]、腦缺血缺氧的保護(hù)[3,9,12-13]、解熱抗炎[14]等作用。由于安息香資源豐富，作用良好，引起了人們的廣泛興趣。本實(shí)驗(yàn)通過對越南安息香95%乙醇水提取物的醋酸乙酯萃取部位進(jìn)行研究，分離得到6個化合物，分別鑒定為()-3-[3-甲氧基- 4-(3-甲氧基-2-氧代丙氧基)苯基]烯丙基苯甲酸酯（ ()-3-[3-methoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)-phenyl] allyl benzoate，1）、2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-(3-羥丙基)-7-甲氧基苯并呋喃[2-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxybenzo- furan，2]、(＋)-雪松素[(+)-cedrusin，3]、(＋)-松脂素[(+)-pinoresinol]（4）、松脂素單甲醚[(+)- pinoresinol monomethy ether]（5）和安息香脂素（styraxin，6），其中化合物1（圖1）經(jīng)文獻(xiàn)檢索為1個新的苯丙素類化合物，命名為白花樹酯醚。同時(shí)，利用CCK-8法對上述6個化合物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒活性研究，結(jié)果表明其對人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肝癌HepG-2細(xì)胞、人乳腺癌MCF細(xì)胞、人前列腺癌PC-3細(xì)胞以及人肺癌A549細(xì)胞均無明顯細(xì)胞毒性，半數(shù)抑制濃度值均大于100mmol/L。

1 儀器與材料

Perkin-Elmer 241MC旋光儀（美國Perkin Elmer公司)；島津UV-2450紫外分光光度儀（日本島津公司）；Bruker VERTE 70紅外分光光度儀、Bruker III-600 NMR核磁共振儀（德國布魯克公司）；安捷倫UPLC/Q-TOF 6230型色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Shimadazu LC-6AD制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agela Cheetah MP200雙波長快速制備色譜（天津博納艾杰爾公司），ODS色譜柱（400 mm×40 mm，50mm，Merck公司）；半制備型反相YMC-Pack ODS-A色譜柱（250 mm×20 mm，10mm）、分析型反相YMC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5mm），日本YMC公司；反相Rp-C18硅膠（50mm，默克公司生產(chǎn)）；薄層色譜硅膠GF254及柱色譜用100～200、200～300目硅膠（青島海洋化工廠）；葡聚糖凝膠SephadexTMLH-20（英國Amersham Pharmacia Biotech AB公司）；Fisher色譜甲醇（美國賽默飛生產(chǎn)）；分析純試劑（國藥集團(tuán)）。

圖1 化合物1平面結(jié)構(gòu)

安息香購自亳州中藥材市場，經(jīng)廣東藥科大學(xué)滕希峰博士鑒定，崔紅花副教授核實(shí)為安息香屬植物白花樹(Pierre) Craib ex Hartw的干燥樹脂。

2 提取與分離

取干燥安息香約5 kg，粉碎，用95%乙醇水浸潤提?。看谓? d，溶劑40 L，共3次），合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮，加適量水使其混懸分散，依次用石油醚（60～90 ℃）（每次5 L，共25 L）、醋酸乙酯（每次5 L，共40 L）等體積萃取，回收溶劑得到石油醚、醋酸乙酯2個萃取部位。取醋酸乙酯萃取部位（約2 kg）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目，8 kg）分離，依次用石油醚-醋酸乙酯（100∶1、50∶1、30∶1、100∶5、15∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶1）梯度洗脫，合并洗脫液得到7個流分Fr. B1～B7。Fr. B2（約598 g）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目，3 kg）分離，得到7個組份（Fr. B2.1～B2.7）。Fr. B2.3（約63.2 g）經(jīng)MCI柱色譜（50～75mm，100 g）分離，依次用甲醇-水（30∶70→100∶0，甲醇量每次增加10%體積分?jǐn)?shù)）梯度洗脫，得到10個流分（Fr. B2.3.1～B2.3.10）。Fr. B2.3.3（約132 mg）經(jīng)反相制備HPLC分離，甲醇-水（85∶15）洗脫，得到化合物4（6.4 mg）。Fr. B2.3.5（約200 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫純化，再經(jīng)反相制備HPLC分離，甲醇-水（58∶42）洗脫，得到化合物2（24 mg）和3（32 mg）。Fr. B2.3.5（約2.1 g）經(jīng)中壓快速制備色譜，甲醇-水（30∶70→90∶10）梯度洗脫，得到5個流份（Fr. B2.3.5.1～B2.3.5.5）。其中Fr. B2.3.5.1（約102 mg）經(jīng)反相制備HPLC分離，甲醇-水（55∶45）洗脫，得到化合物5（12 mg）；Fr. B2.3.5.1（約124 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫純化，再經(jīng)反相制備HPLC分離，甲醇-水（60∶40）洗脫，得到化合物6（9 mg）。Fr. B2.3.7（約90 mg）經(jīng)反相制備HPLC分離，甲醇-水（73∶27）洗脫，得到化合物1（4.7 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

1H- 和13C-NMR譜數(shù)據(jù)（表1）及HSQC實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到化合物1中有21個碳信號，包括10個不飽和次甲基、6個季碳（其中2個羰基季碳，4個不飽和季碳）、3個飽和亞甲基和2個飽和甲基（表1）。1H-NMR譜中顯示有2組苯環(huán)氫信號，其中6.77 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 6.92 (1H, dd,= 8.3, 1.9 Hz, H-6), 6.99 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2) 為ABX偶合關(guān)系，表明存在1個1,3,4-三取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)；8.08 (2H, dd,= 8.4, 1.3 Hz, H-2, 6), 7.45 (2H, m, H-3, 5) 和7.56 (1H, m, H-4)，表明還存在1個單取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)。從1H-1H COSY譜中，可知化合物1具有-CH=CH-CH=CH-CH=、-CH2-CH=CH-、=CH-CH=和-CH2-CH3片段（圖2所示）。

從HMBC譜（圖2）中可知，H-2′和C-7′ (C166.6) 相關(guān)，H-9分別和C-7′、C-9相關(guān)，H-8和C-1相關(guān)以及H-7和C-2相關(guān)，結(jié)合4.97 (2H, dd,= 6.5, 1.2 Hz, H-9) 其碳信號65.8 (C-9)，表明結(jié)構(gòu)中存在苯甲酸苯烯丙酯片段。同時(shí)，苯甲酸苯烯丙酯片段中烯丙醇部分的烯氫信號6.68 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7), 6.30 (1H, dt,= 15.8, 6.5 Hz, H-8) 的偶合常數(shù)較大，表明烯氫為反式構(gòu)型，即式。在HMBC譜中觀察到甲氧基氫信號 [H3.91 (3H, s)] 和 C-3 (C149.9) 相關(guān)以及H-5和C-3相關(guān)，表明甲氧基處于C-3位。上述結(jié)構(gòu)片段的譜學(xué)數(shù)據(jù)和已知化合物()-3-(3,4-dimethoxyphenyl)allyl benzoate相應(yīng)數(shù)據(jù)[15]基本一致，同時(shí)，通過譜學(xué)數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)化合物1和()-3-(3,4-dimethoxyphenyl) allyl benzoate結(jié)構(gòu)上的差異僅僅在于C-4位取代基不同。而在HMBC譜中H2-10和C-4、C-11相關(guān)，H-12和C-11相關(guān)以及H-2、H-6和C-4相關(guān)，結(jié)合碳信號147.6 (C-4) 和66.7 (C-10)，表明苯甲酸苯烯丙酯片段和醋酸乙酯片段通過C-4和C-10，經(jīng)由原子相連。綜上所述，確定了化合物1的結(jié)構(gòu)為()-3- [3-甲氧基-4-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯基]烯丙基苯甲酸酯，經(jīng)檢索為新化合物，命名為白花樹酯醚。

表1 化合物1的1H-NMR (600 MHz, CD3OD) 和13C-NMR (150 MHz, CD3OD) 數(shù)據(jù)

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY(━) 和HMBC相關(guān)

化合物2：白色無定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.79 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2′), 7.34 (1H, dd,= 8.0, 2.1 Hz, H-6′), 7.37 (1H, br. s, H-4), 6.98 (1H, s, H-3), 6.95 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.66 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6), 3.99 (3H, s, 7-OCH3), 3.96 (3H, s, 3′-OCH3), 3.65 (2H, t,= 6.5 Hz, H-3′′), 2.77 (2H, t,= 7.4 Hz, H-1′′), 1.92 (2H, m, H-2′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 157.2 (C-2), 100.9 (C-3), 113.0 (C-4), 138.3 (C-5), 108.4 (C-6), 143.3 (C-7), 147.5 (C-7a), 124.3 (C-3a), 132.3 (C-1′), 110.1(C-2′), 146.9 (C-3′), 145.3 (C-4′), 119.3 (C-5′), 116.4 (C-6′), 35.8 (C-1′′), 33.4 (C-2′′), 62.4 (C-3′′), 56.8 (7-OCH3), 56.7 (3′-OCH3)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致[16]，故鑒定化合物2為2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-(3-羥丙基)-7-甲氧基苯并呋喃。

化合物5：白色無定形粉末。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.97 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.99 (1H, s, H-2′), 6.77 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd,= 8.2, 1.7 Hz, H-6), 6.93 (2H, m, H-5′, 6′), 4.75 (1H, d,= 4.3 Hz, H-7), 4.73 (1H, d,= 4.3 Hz, H-7′), 3.16 (2H, m, H-8, 8′), 4.29～4.17 (2H, m, H-9b, 9b′), 3.86 (2H, m, H-9a, 9a′), 3.87 (3H, s, 3-OCH3), 3.85 (3H, s, 3′-OCH3), 3.84 (3H, s, 4′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 134.6 (C-1), 109.9 (C-2), 149.1 (C-3), 147.1 (C-4), 115.4 (C-5), 119.2 (C-6), 86.8 (C-7), 54.8 (C-8, 8′), 72.2 (C-9), 133.4 (C-1′), 109.7 (C-2′), 149.9 (C-3′), 149.6 (C-4′), 112.1 (C-5′), 119.4 (C-6′), 86.6 (C-7′), 72.1 (C-9′), 55.8 (3, 3′-OCH3), 55.6 (4-OCH3)。上述譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致[19]，故鑒定化合物5為松脂素單甲醚。

化合物6：白色無定形粉末。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.99 (2H, s, -OCH2O-), 6.92 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 6.77 (1H, dd,= 8.0, 1.8 Hz, H-5), 6.88 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 5.32 (1H, d,= 3.6 Hz, H-7), 3.44 (1H, dd,= 9.1, 3.6 Hz, H-8), 6.84 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 7.01 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.79 (1H, dd,= 8.0, 2.0 Hz, H-6′), 5.30 (1H, d,= 3.6 Hz, H-7′), 3.21 (1H, m, H-8′), 4.30 (1H, dd,= 9.4, 4.7 Hz, H-9′a), 4.33 (1H, dd,= 9.2, 7.0 Hz, H-9′b), 3.94 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 132.5 (C-1), 108.6 (C-2), 148.4 (C-3), 148.7 (C-4), 105.9 (C-5), 118.1 (C-6), 83.5 (C-7), 53.5 (C-8), 176.9 (C-9), 133.3 (C-1′), 108.3 (C-2′), 146.8 (C-3′), 145.6 (C-4′), 114.5 (C-5′), 119.0 (C-6′), 84.8 (C-7′), 50.1 (C-8′), 72.9 (C-9′), 101.5 (-OCH2O-), 56.2 (3′-OCH3)。上述譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致[20]，故鑒定化合物6為安息香脂素。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對越南安息香95%乙醇水浸提物的醋酸乙酯萃取部位進(jìn)行分離純化，得到6個化合物，其中化合物1為新的苯丙素類化合物，化合物2～6為首次從該植物中分離得到。

利用CCK-8法[21]評價(jià)了所得6個化合物對人宮頸癌HeLa細(xì)胞株、人肝癌HepG-2細(xì)胞株、人乳腺癌MCF細(xì)胞株、人前列腺癌PC-3細(xì)胞株以及人肺癌A549細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，其中對照品順鉑的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為35～40mmol/L，而所得化合物的IC50值均大于100mmol/L，結(jié)果表明上述6個化合物均無明顯細(xì)胞毒活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用中藥安息香提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new phenylpropanoid from resin of

FANG Zhen-feng1, FANG Hui1, WANG Feng2, 3

1. Department of Pharmacy, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056, China 2. Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM,Guangzhou 510006, China 3. Engineering & Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of Guangdong Province, Guangzhou 510006, China

To study chemical constituents from the resin of(Pierre) Craib ex Hartw and their cytotoxicities.The compounds were isolated by column chromatography over MCI gel CHP-20P, silica gel, Sephadex HL-20, and flash chromatography coupled with preparative HPLC. Their structures were elucidated by spectroscopic analysis including IR, 1D-NMR, 2D-NMR, and HR-ESI-MS. Furthermore, the cytotoxicities of the chemical components against HepG-2, A549, HeLa, MCF-7, and PC-3 cell lines were measured by CCK-8 method.Six compounds, ()-3-[3-methoxy- 4-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)-phenyl]allyl benzoate (1), 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxybenzofuran (2), (+)-cedrusin (3), (+)-pinoresinol (4), (+)-pinoresinol monomethy ether (5), and styraxin (6) were isolated from the resin of. And the IC50values of the six compounds to HeLa, HepG-2, MCF, PC-3 and A549 cell lines were more than 100mmol/L.Compound 1 is identified as a new phenylpropanoid named as stytonkinether, and compounds 2—6 are isolated from the resin of this plant for the first time. And all six compounds show no obviously cytotoxic activities.

Linn.;(Pierre) Craib ex Hartw; phenylpropanoid; stytonkinether; cytotoxity; (+)-cedrusin;styraxin

R284.1

A

0253 - 2670(2021)21 - 6455 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.001

2021-05-26

廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2021A1515011529）

方振峰（1980—），湖北人，博士，副教授，從事天然產(chǎn)物活性成分研究。Tel: (027)84225149 E-mail: zhenfengfang@163.com

王 峰，博士，副教授，從事活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)及中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (020)39352181 E-mail: wfeng1230@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]