樊曉荃，付 娟，胡軍華，肖 偉，王振中1, *

UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析六味地黃苷糖片化學(xué)成分

樊曉荃1, 3，付 娟2, 3，胡軍華2, 3，肖 偉2, 3，王振中1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)六味地黃苷糖片中的化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒定。色譜柱為Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.3%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL；采用電噴霧離子源，負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，根據(jù)精確質(zhì)荷比、二級(jí)碎片離子信息，結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)鑒定六味地黃苷糖片中的化學(xué)成分。共鑒定和推測(cè)出71個(gè)化合物，其中25個(gè)來自酒萸肉、19個(gè)來自熟地黃、31個(gè)來自牡丹皮、2個(gè)來自澤瀉、3個(gè)來自茯苓、2個(gè)來自山藥。其中22個(gè)化合物經(jīng)對(duì)照品驗(yàn)證?；久鞔_了六味地黃苷糖片的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為六味地黃苷糖片的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。

六味地黃苷糖片；質(zhì)譜分析；質(zhì)量控制；化學(xué)成分譜；酒萸肉；熟地黃；牡丹皮；澤瀉；茯苓；山藥

六味地黃湯是中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方，由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成[1]，由宋朝名醫(yī)錢乙首創(chuàng)，主要用于腰膝酸軟、頭暈?zāi)垦！⒍@耳鳴、盜汗自汗等腎陰不足之癥[2]。近代實(shí)踐證明，六味地黃方廣泛應(yīng)用于治療腎臟疾病、更年期綜合癥、高血壓、肝臟疾病等數(shù)10種疾病[3-5]。

六味地黃苷糖片是基于對(duì)六味地黃湯的大量基礎(chǔ)研究開發(fā)而成，用于治療伴有腎陰虛的更年期綜合癥。該藥從湯劑出發(fā)，經(jīng)過2步醇沉、2步色譜分離得到了苷類、多糖以及寡糖3個(gè)有效部位，在此基礎(chǔ)上得到了六味地黃苷糖片。

研究表明六味地黃苷糖片具有改善慢性多重不可預(yù)期應(yīng)激所致焦慮抑郁樣行為及阿爾茨海默病動(dòng)物模型轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知缺陷的作用[5]，其中苷類成分對(duì)免疫及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)起重要作用[6]。為闡明六味地黃苷糖片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)六味地黃苷糖片中的化學(xué)成分（主要為苷類成分）進(jìn)行了研究，運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)六味地黃苷糖片中的成分進(jìn)行定性分析，為六味地黃苷糖片的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，美國安捷倫公司）；Agilent 6538 Q-TOF質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；Mettler Toledo XP6型電子分析天平（百萬分之一，瑞士梅特勒公司）；Mettler Toledo AL204電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q Academic純水儀（美國密理博公司）。色譜乙腈（德國默克公司）；色譜甲酸（美國天地公司）。

莫諾苷（批號(hào)111998-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、馬錢苷（批號(hào)111640-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201943，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、馬錢苷酸（批號(hào)111865-201704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、獐芽菜苦苷（批號(hào)110785-201404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%）、沒食子酸（批號(hào)110831-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.8%）、中國食品藥品檢定研究院；牡丹酚原苷（批號(hào)200302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、腺苷（批號(hào)201901，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、松果菊苷（批號(hào)201904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、沒食子酰芍藥苷（批號(hào)201901，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），南京森貝伽生物科技有限公司；獐芽菜苷（批號(hào)7001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、異毛蕊花糖苷（批號(hào)7283，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、地黃苷D（批號(hào)7433，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、焦地黃苯乙醇苷B（批號(hào)LOT8184，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），上海施丹德生物技術(shù)有限公司；氧化芍藥苷（批號(hào)19120604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.67%）、山茱萸新苷（批號(hào)19080905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、連翹酯苷E（批號(hào)DSTDL008301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、丹皮酚新苷（批號(hào)DST200910-076，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、8-表番木鰲酸（批號(hào)DST200422-157，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），成都德思特生物技術(shù)有限公司。六味地黃苷糖片（批號(hào)20181001），江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司。

2 方法

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.3%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～22 min，4%～8% A；31～60 min，8%～14% A；65～80 min，18%～25% A；85 min，90% A），柱溫35 ℃，體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓4000 V，質(zhì)量掃描范圍100～2000；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣體積流量10 L/min；霧化氣壓力275.75 kPa；裂解電壓100 V；錐孔電壓65 V；碰撞能量根據(jù)不同化合物的需要選取15～40 eV。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、牡丹酚原苷、丹皮酚新苷、山茱萸新苷、腺苷、獐芽菜苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、松果菊苷、氧化芍藥苷、地黃苷D、沒食子酰芍藥苷、8-表番木鰲酸、焦地黃苯乙醇苷B、獐牙菜苦苷、連翹酯苷E、馬錢苷酸、沒食子酸適量置于量瓶中，用水溶解稀釋至刻度，制備成含各成分50～100 μg/mL混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過備用。

2.2.2 供試品溶液的配制 取六味地黃苷糖片10片，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加純水適量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）5 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

3 結(jié)果與分析

按“2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)六味地黃苷糖片供試品溶液，得到對(duì)照品及六味地黃苷糖片負(fù)離子模式下總離子色譜圖，見圖1、2。根據(jù)精確質(zhì)荷比，二級(jí)碎片離子信息，結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)共鑒定和推測(cè)出71個(gè)化合物，其中25個(gè)來自酒萸肉，19個(gè)來自熟地黃，31個(gè)來自牡丹皮，2個(gè)來自澤瀉，3個(gè)來自茯苓，2個(gè)來自山藥。所測(cè)得成分中有20個(gè)化合物經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)得到鑒定，結(jié)果見表1。

3.1 苯乙醇苷類化合物

此類化合物均來自熟地黃藥材。該類化合物通常是由咖啡?；?、苯乙醇苷元和糖連接而成，通常在質(zhì)譜中均可檢測(cè)出[M－H－162]?，是由準(zhǔn)分子離子脫去1個(gè)葡萄糖基[M－H－C6H10O5]?或1個(gè)咖啡?；鵞M－H－C9H6O3]?得到的，因此可以根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)來判斷脫掉的基團(tuán)。以峰58為例，在負(fù)離子模式下有準(zhǔn)分子離子峰/799.266 0，二級(jí)質(zhì)譜得到了/623.220 5、477.162 7、297.133 5297.133 5等碎片，推測(cè)為峰58化合物母離子先后丟失了1個(gè)CH2、1個(gè)咖啡?；–9H6O3）、1個(gè)鼠李糖基（C6H10O4）以及1分子葡萄糖（C6H12O6），結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[14]碎片推測(cè)峰58為焦地黃苯乙醇苷A，見圖3、4。

圖1 負(fù)離子模式下對(duì)照品總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下六味地黃苷糖片總離子流圖

表1 六味地黃苷糖片化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

*通過對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)的成分 A-酒萸肉 B-熟地黃 C-牡丹皮 D-澤瀉 E-茯苓 F-山藥

*-comfirmed by reference materials A-B-C-D-E-F-

圖3 焦地黃苯乙醇苷A的MS/MS圖

圖4 焦地黃苯乙醇苷A可能的裂解途徑

結(jié)合碎片離子及文獻(xiàn)報(bào)道[7,14]，峰52、53、64、65、67、71分別為脫咖啡酸毛蕊花糖苷、洋地黃葉苷C、松果菊苷、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B、異毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷D。

3.2 單萜苷類

單萜苷類化合物主要來自于牡丹皮，這類成分通常由單萜部分（蒎烷骨架C9H9O3）與葡萄糖脫水縮合同時(shí)進(jìn)行與芳香酸類化合物的酯化得到。在流動(dòng)相中有甲酸的情況下，單萜苷類化合物通常會(huì)得到[M－H＋HCOOH]?的離子峰，以峰49為例（圖5），經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后確認(rèn)為芍藥苷，負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜中有準(zhǔn)分子離子峰/479.151 0同時(shí)出現(xiàn)了[M－H＋HCOOH]?峰/525.157 7，二級(jí)質(zhì)譜中可以觀察到丟失了HCHO后的碎片離子/449.130 0 [M－H－HCHO]?、丟失了HCHO和苯甲酸的碎片離子/327.095 7 [M－H－HCHO－C7H6O2]?以及丟失了糖基和苯甲酸的碎片離子[M－H－C6H10O5－C7H6O2]?/195.065 0，此外還發(fā)現(xiàn)了蒎烷骨架的碎片離子/165.055 5 [M－H－HCHO－C7H6O2－C6H10O5]?，可能的裂解途徑見圖6。峰11，負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜中有準(zhǔn)分子離子峰/463.136 5，二級(jí)質(zhì)譜中可以觀察到蒎烷骨架離子/165.062 0，結(jié)合碎片及文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]推斷峰11為mudanpioside B。峰34經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)為氧化芍藥苷，有準(zhǔn)分子離子峰/495.150 3，二級(jí)質(zhì)譜下可見/465.132 5 [M－H－HCHO]?及蒎烷骨架離子/165.053 6。峰38、39、50、63有相同規(guī)律，分別推測(cè)為mudanpioside I、mudanpioside E、galloyloxypaeoniflorin、沒食子酰芍藥苷。

圖5 芍藥苷的MS/MS圖

圖6 芍藥苷可能的裂解途徑

3.3 糖苷類

糖苷類化合物主要來自酒萸肉、牡丹皮、熟地黃，多具有沒食子酸或葡萄糖結(jié)構(gòu)。以峰57為例（圖7），準(zhǔn)分子離子峰為/787.096 3，二級(jí)質(zhì)譜中可見碎片/635.194 8、617.075 6、465.068 5、447.059 5、313.059 3、295.044 5，結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)為1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖，可能的裂解途徑見圖8。結(jié)合碎片離子及文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]，推測(cè)峰9、15為digalloylglucose，峰40、48、51為三沒食子酰葡萄糖，峰66為五沒食子酰葡萄糖。結(jié)合對(duì)照品及推測(cè)峰42、46分別為牡丹酚原苷、丹皮酚新苷。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]推測(cè)峰55、56為suffruticoside A/C，峰61、62為suffruticoside B/D。

峰33經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)為莫諾苷，準(zhǔn)分子離子峰為/405.139 0，一級(jí)質(zhì)譜下可以觀察到/451.130 0 [M－H＋HCOOH]?，二級(jí)質(zhì)譜中觀察到/243.077 2 [M－H－C6H10O5]?、225.066 4 [M－H－C6H10O5－H2O]?、141.048 7 [M－H－C6H10O5－C4H6O3]?，質(zhì)譜信息及可能的裂解途徑見圖9、10。結(jié)合碎片離子及文獻(xiàn)報(bào)道[12,22-27]推測(cè)峰10、12、13、30、32、37、43～45、70分別為地黃苷D、7--乙基莫諾苷、密力特苷、金吉苷、二氫山茱萸苷、獐芽菜苦苷、馬鞭草苷、獐芽菜苷、馬錢苷、山茱萸新苷。

圖7 1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖的MS/MS圖

圖8 1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖可能的裂解途徑

圖9 莫諾苷的MS/MS圖

圖10 莫諾苷可能的裂解途徑

4 討論

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活節(jié)奏逐漸變快，更年期綜合征的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給患者帶來很大困擾，并影響其生活質(zhì)量和身心健康。針對(duì)這一問題，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按照由“中藥飲片組方（飲片配伍）向中藥復(fù)方活性成分群組方（組分配伍）發(fā)展”的中藥經(jīng)典方劑“二次開發(fā)”思路，對(duì)六味地黃方活性物質(zhì)組方進(jìn)行了探討，從湯劑出發(fā)，經(jīng)過兩步醇沉、兩步色譜分離得到了苷類、多糖以及寡糖3個(gè)有效部位，在此基礎(chǔ)上得到了六味地黃苷糖片。六味地黃苷糖片現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏完善的質(zhì)量控制方法，為闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)會(huì)對(duì)六味地黃苷糖片中的化學(xué)成分進(jìn)行定量、入血實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)六味地黃苷糖片中的化學(xué)成分進(jìn)行了快速分析，結(jié)合單味藥材對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行了歸屬，并通過一級(jí)質(zhì)譜獲得的準(zhǔn)分子離子峰推測(cè)鑒定出了71個(gè)六味地黃苷糖片中可能含有的化合物。其中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、牡丹酚原苷等20個(gè)化合物經(jīng)由對(duì)照品指認(rèn)，其余成分通過二級(jí)質(zhì)譜提供的碎片離子結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)指認(rèn)，因六味地黃苷糖片中含有較多環(huán)烯醚萜苷類成分，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]及實(shí)際情況選擇了在負(fù)離子模式下檢測(cè)，指認(rèn)結(jié)果顯示來自澤瀉、茯苓、山藥中的成分較少，推測(cè)3味藥材在六味地黃苷糖片中主要提供糖類成分，因此未能檢出，后續(xù)需進(jìn)一步完善。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)六味地黃苷糖片進(jìn)行了全面系統(tǒng)地解析，為六味地黃苷糖片后續(xù)的入血實(shí)驗(yàn)研究和關(guān)鍵成分定量控制提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Rapid identification of chemical components in Liuwei dihuang gantang Tablets by UPLC-Q-TOF-MS/MS

FAN Xiao-quan1, 3, FU Juan2, 3, HU Jun-hua2, 3, XIAO Wei2, 3, WANG Zhen-zhong1, 2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China 2. Jangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China

To study the chemical constituents in Liuwei Dihuang gantang tablets (六味地黃糖苷片) by using UPLC-Q-TOF-MS/MS.The chromatographic conditions were as follows: Phenomenex Luna C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column with acetonitrile and 0.3% formic acid as mobile phase, gradient elution, flow rate of 1 mL/min, The column temperature was 35 degrees, the injection volume was 10 L; mass spectrometry conditions: The data were collected by electrospray ion source (ESI) under negative ion mode. These components were further analyzed based on the accurate mass ratio, the two level fragment ion information, the reference materials and literature data.A total of 71 compounds were identified and speculated, 25 of which came from liquor cornus, 19 from, 31 from, 2 from, 3 fromand 2 from. Among them, 22 compounds were verified by reference substance.The results basically clarified the chemical basis of Liuwei Dihuang gantang tablets, and provided a reference for the quality control and pharmacodynamic material basis of Liuwei Dihuang gantang tablets.

Liuwei Dihuang gantang tablets;mass spectrometry;quality control;chemical composition spectrum;liquor cornus;;;;;

R284.1

A

0253 - 2670(2021)21 - 6473 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.004

2021-03-18

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（2013ZX09402203）

樊曉荃，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治?。Tel: 15720600226 E-mail: 815405571@qq.com

王振中，男，高級(jí)工程師，博士，主要從事中藥新劑型研發(fā)。Tel: (0518)81522367 E-mail: wzhzh-nj@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]