李艷玲，丁 煌，傅馨瑩，唐 三，陸展輝，楊芙蓉，劉曉丹，鄧常清

? 藥理與臨床 ?

黃芪甲苷配伍三七總皂苷對(duì)腦缺血大鼠BMSCs移植后神經(jīng)修復(fù)的影響

李艷玲，丁 煌，傅馨瑩，唐 三，陸展輝，楊芙蓉，劉曉丹*，鄧常清*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

探討黃芪甲苷IV（astragaloside IV，AST IV）與三七總皂苷（saponins，PNS）配伍聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的影響。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組、BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組。全骨髓貼壁法分離、純化BMSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34、CD45陽性表達(dá)率。各給藥組給予藥物進(jìn)行干預(yù)，采用大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立局灶性腦缺血模型，采用Longa法測(cè)定各組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀；采用蘇木素-伊紅（HE）染色與尼氏染色測(cè)定各組大鼠腦組織病理變化；采用免疫熒光法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)BMSCs和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）陽性表達(dá)；采用Western blotting法測(cè)定各組大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）蛋白表達(dá)。成功分離培養(yǎng)BMSCs，表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34、CD45鑒定符合BMSCs特征。大鼠腦缺血后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀及腦組織病理損傷，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織細(xì)胞損傷率顯著升高（＜0.01），尼氏體數(shù)量顯著減少（＜0.01）；各給藥組均能夠不同程度減輕上述病理改變，其中效應(yīng)最強(qiáng)為BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS高劑量組（＜0.01），優(yōu)于單用藥物和單用BMSCs輸注。大鼠腦缺血后神經(jīng)元損傷，輸注BMSCs后，細(xì)胞可在缺血側(cè)腦組織增殖并分化為神經(jīng)元，藥物聯(lián)合BMSCs輸注能夠增強(qiáng)BMSCs在大鼠腦內(nèi)的增殖和分化。大鼠腦缺血后，BDNF和GDNF蛋白表達(dá)增加，各藥物組均能夠不同程度上調(diào)其表達(dá)，其中效應(yīng)最強(qiáng)為BMSCs輸注聯(lián)合ASTⅣ＋PNS組（＜0.01），優(yōu)于單用藥物和單用BMSCs輸注。AST Ⅳ配伍PNS能夠促進(jìn)BMSCs移植的存活，靶向修復(fù)腦缺血后受損神經(jīng)元，其機(jī)制可能與改善腦缺血后腦內(nèi)局部微環(huán)境，促進(jìn)移植干細(xì)胞的存活、增殖和分化有關(guān)。

黃芪甲苷；三七總皂苷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腦缺血；增殖；遷移；神經(jīng)分化

缺血性腦損傷的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和治療費(fèi)用高等特點(diǎn)，且目前受治療時(shí)間窗限制，臨床上大部分病人均未得到有效的救治。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛力，其移植后對(duì)缺血性實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能具有改善作用，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種新的治療途徑[1]。但目前BMSCs的移植存在在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)成活率較低且向神經(jīng)細(xì)胞定向分化能力不足等問題。因此，促進(jìn)BMSCs移植后在體內(nèi)的增殖并向神經(jīng)細(xì)胞定向分化是目前研究的重點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，中藥復(fù)方及有效單體能夠誘導(dǎo)BMSCs的分化，開辟了中藥干預(yù)BMSCs治療心腦血管疾病的新途徑。

黃芪甲苷IV（astragaloside IV，AST IV）和三七總皂苷（saponins，PNS）是黃芪和三七發(fā)揮心腦血管保護(hù)效應(yīng)的有效組分。本課題組前期大量研究證實(shí)[5-7]，黃芪總苷的有效成分AST IV和PNS配伍可多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，并在體外能夠促進(jìn)缺血再灌注模型BMSCs增殖、遷移，抑制其凋亡，誘導(dǎo)其向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞定向分化?；诖?，本研究采用大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立缺血性腦損傷模型，觀察黃芪和三七主要有效成分AST IV和PNS配伍促BMSCs移植對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)修復(fù)的作用，為中藥有效組分配伍促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)修復(fù)的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

3周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（150±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)ZS-202008110006；8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)ZS-202008040008。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SKY（湘）2013-0005。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d，造模前禁食12 h，自由飲水。動(dòng)物的使用符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定，批準(zhǔn)號(hào)LLBH-202004290001。

1.2 藥品與試劑

AST IV（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)AF9102805）、PNS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，批號(hào)AF20033002）購自成都埃法生物科技有限公司；PKH26Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit（批號(hào)MINI25-1KT）購自美國(guó)Sigma公司；CD29-FITC（批號(hào)HMb1-1）、CD90-FITC（批號(hào)HIS51）、CD34-PI（批號(hào)4H11）、CD45-PI（批號(hào)OX1）購自美國(guó)eBioscience公司；兔抗大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）單克隆抗體（批號(hào)ab108319）、兔抗大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）單克隆抗體（批號(hào)ab176564）、兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）單克隆抗體（批號(hào)ab180943）購自英國(guó)Abcam公司；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（批號(hào)20536-1-AP）、山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)SA00001-2）購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；L-DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AF29527017）購自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（批號(hào)SA190501）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)A00445）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；MCAO栓線（批號(hào)2634-A4）購自北京西濃科技有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（批號(hào)GB27303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DxP Athenatm流式細(xì)胞儀（上海迪發(fā)儀器儀表有限公司）；Chemi-DoC-XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析儀、CYTATION5多功能酶標(biāo)成像系統(tǒng)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Eclipse C1正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

根據(jù)課題組前期方法[7]，取體質(zhì)量（150±20）g的SD大鼠進(jìn)行BMSCs分離、培養(yǎng)以及細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34、CD45的檢測(cè)。大鼠尾iv第3代BMSCs（1×104/mL）前用PKH26Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記使細(xì)胞自發(fā)紅光。

2.2 大鼠MCAO模型制備

參照Longa法改良[8]，取體質(zhì)量（220±20）g的SD大鼠，ip 10%水合氯酸（300 mg/kg）麻醉，頸正中切口，依次分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈及其所有分支動(dòng)脈，在右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處做一切口，向右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入栓線，推進(jìn)17～20 mm感阻力時(shí)停止，固定栓線，縫合皮膚，此時(shí)即完成一側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞。對(duì)照組大鼠僅分離血管，不進(jìn)行血管結(jié)扎及線栓導(dǎo)入。

2.3 分組及給藥

根據(jù)前期的研究結(jié)果[6]，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組、BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組，每組10只。藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的混懸液。于造模前1 d，各給藥組ig 1 mL相應(yīng)藥物，2次/d，并尾iv 1 mL 0.9%氯化鈉溶液，1次/d；對(duì)照組和模型組ig等體積0.5% CMCNa并尾iv等體積0.9%氯化鈉溶液。于給藥后24 h行MCAO，術(shù)后除BMSCs輸注組及BMSCs輸注與藥物聯(lián)用組外同前給藥，BMSCs輸注組尾iv BMSCs并ig等體積0.5% CMCNa，BMSCs輸注與藥物聯(lián)用組尾iv BMSCs并ig相應(yīng)藥物，術(shù)后連續(xù)給藥2 d。缺血7 d后處死大鼠，取材。

2.4 Longa法測(cè)定大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

大鼠造模清醒后每天采用Longa神經(jīng)功能評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無神經(jīng)功能缺損體征；1分，患側(cè)前爪不能完全伸展，為輕度神經(jīng)功能缺損；2分，行走時(shí)大鼠身體向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，為中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時(shí)大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒，為重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)性走并伴有意識(shí)障礙。選取實(shí)驗(yàn)第7天的評(píng)分結(jié)果進(jìn)行分析。

2.5 蘇木素-伊紅（HE）染色考察大鼠腦組織病理變化

造模7 d后，再次麻醉大鼠，以0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行心臟灌注后，斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛固定，固定結(jié)束后進(jìn)行切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、蘇木素染色、清洗、伊紅染色、乙醇梯度脫水、封片，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件分析缺血側(cè)腦組織海馬CA1區(qū)的病理損傷情況，計(jì)算每個(gè)視野下的總細(xì)胞數(shù)和損傷細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞損傷率。

細(xì)胞損傷率＝損傷細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

2.6 尼氏染色測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞的損傷

取各組大鼠損傷側(cè)腦組織，置于4%多聚甲醛固定，固定結(jié)束后進(jìn)行切片、脫蠟、甲基紫染色、沖洗、分化、封片，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)單位面積下尼氏體染色陽性數(shù)。

2.7 熒光雙標(biāo)法測(cè)定大鼠海馬區(qū)BMSCs和NSE表達(dá)

取各組大鼠損傷側(cè)腦組織，固定后切片，石蠟切片脫蠟，置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）的修復(fù)盒中，于微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加3% BSA孵育30 min進(jìn)行封閉，滴加兔抗大鼠NSE單克隆一抗（1∶500），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（1∶500），加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min；滴加DAPI染液，封片，烘干后于顯微鏡下觀察并拍照，BMSCs為自發(fā)的紅色熒光，NSE為FITC標(biāo)記的綠色熒光。采用Image J軟件分析BMSCs和NSE共表達(dá)區(qū)的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)。

2.8 Western blotting檢測(cè)大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達(dá)

取大鼠大腦患側(cè)視交叉后3～4 mm腦組織25 mg，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1～2 h，分別加入兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（1∶10 000）、兔抗大鼠BDNF單克隆抗體（1∶8000）、兔抗大鼠GDNF單克隆抗體（1∶8000），4 ℃孵育過夜；TBST清洗3次，再加入山羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后，顯影，采用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 BMSCs的鑒定

如圖1所示，BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD34、CD45陽性率分別為80.4%、88.1%、4.5%、10.4%，原代細(xì)胞符合BMSCs表面抗原特征，鑒定為BMSCs。

3.2 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（＜0.05、0.01）；與AST IV＋PNS低、高劑量組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降（＜0.01）；與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（＜0.01）。

3.3 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)腦組織形態(tài)損傷的影響

如圖3、4所示，對(duì)照組海馬CA1區(qū)無明顯病理學(xué)改變，錐體細(xì)胞排列整齊規(guī)則，形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，染色質(zhì)分布均勻。與對(duì)照組比較，模型組CA1區(qū)錐體細(xì)胞缺失較多，而且殘留的錐體細(xì)胞排列不整齊，形態(tài)不完整，多數(shù)錐體細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，核仁不清晰，細(xì)胞損傷率顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組細(xì)胞損傷率顯著降低（＜0.05、0.01）；與AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組比較，AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組聯(lián)合BMSCs輸注組細(xì)胞損傷率顯著降低（＜0.01）；與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組細(xì)胞損傷率顯著降低（＜0.01）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原

1-對(duì)照組 2-模型組 3-AST IV＋PNS低劑量組 4-AST IV＋PNS高劑量組 5-BMSCs輸注組 6-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組 7-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組 與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組比較：**P＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組比較：&&P＜0.01；與BMSCs輸注組比較：■■P＜0.01，圖4、7同

3.4 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠海馬區(qū)尼氏體數(shù)目的影響

如圖5和表1所示，對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見大量深藍(lán)色斑塊狀尼氏體；與對(duì)照組比較，模型組尼氏體數(shù)量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組以及BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組尼氏體數(shù)量顯著增加（＜0.01）；與AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組比較，AST Ⅳ＋PNS低、高劑量聯(lián)合BMSCs輸注組尼氏體數(shù)量顯著增多（＜0.01）；與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組尼氏體數(shù)量顯著增多（＜0.01）。

3.5 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠腦組織NSE蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組海馬區(qū)NSE/ BMSCs陽性表達(dá)顯著升高（＜0.05）。

圖3 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠腦組織海馬區(qū)病理變化的影響(HE, ×200)

3.6 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組以及BMSCs輸注組GDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組GDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低劑量組BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS高劑量組腦組織BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），GDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

圖4 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞損傷率的影響(, n = 5)

4 討論

缺血性腦損傷的病理是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，目前已知的病理機(jī)制主要有興奮性氨基酸毒性、氧自由基過度生成、Ca2+超載、炎性反應(yīng)等，這些病理反應(yīng)引起的微環(huán)境變化發(fā)生在腦缺血的各個(gè)階段且相互作用[9]，造成血腦屏障破壞、血管損傷、神經(jīng)細(xì)胞腫脹，發(fā)生炎型反應(yīng)，產(chǎn)生大量的有害因子，進(jìn)一步加重腦損傷。針對(duì)腦缺血后的各種損傷變化，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞給予及時(shí)的保護(hù)，對(duì)減少神經(jīng)功能缺損、改善預(yù)后具有重要意義。BMSCs是一種多能干細(xì)胞，具有來源廣、易培養(yǎng)、低免疫原性和無倫理學(xué)爭(zhēng)議的優(yōu)勢(shì)，可作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想種子[10]，其治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要方式為直接修復(fù)和間接修復(fù)：直接修復(fù)是BMSCs直接分化神經(jīng)細(xì)胞參與組織的修復(fù)和再生；間接修復(fù)則是BMSCs通過分泌一些物質(zhì)從而達(dá)到組織的修復(fù)作用[11-12]。但單一的BMSCs移植后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)存活率低和定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力不足，這可能與缺血后腦內(nèi)微環(huán)境的改變有關(guān)。

圖5 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠海馬區(qū)尼氏體的影響 (×200)

表1 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠海馬區(qū)尼氏體數(shù)目的影響(, n = 5)

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：▲▲＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組比較：**＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組比較：&&＜0.01；與BMSCs輸注組比較：■■＜0.01

#< 0.05##< 0.01control group;▲< 0.05▲▲< 0.01model group;**< 0.01BMSCs infusion combined with AST IV + PNS low dose group;&&< 0.01BMSCs infusion combined with AST IV + PNS high dose group;■■< 0.01BMSCs infusion group

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦缺血屬于腦卒中范疇，氣虛血瘀為其主要病機(jī)，益氣活血法為其主要治法。黃芪和三七是治療心腦血管的主要有效中藥，黃芪益氣，三七活血，兩者配伍具有益氣活血的功效。本課題組前期對(duì)黃芪和三七的有效組（成）分配伍抗缺血性腦損傷的作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究[13-17]，發(fā)現(xiàn)AST IV配伍PNS可減輕腦組織炎型反應(yīng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善腦組織能量代謝、提高腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞存活率、促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)，進(jìn)而改善腦缺血后微環(huán)境；最新研究發(fā)現(xiàn)[7]，AST IV配伍PNS在體外可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

1-BMSCs輸注組 2-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組 3-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組 與BMSCs輸注組比較：■P＜0.05

圖7 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對(duì)大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

為進(jìn)一步驗(yàn)證AST IV配伍PNS是否能夠改善腦缺血后微環(huán)境，促進(jìn)BMSCs移植后細(xì)胞的存活、增殖及定向分化，減輕腦缺血后神經(jīng)損傷，本研究建立MCAO模型，探究AST IV配伍PNS對(duì)腦缺血大鼠BMSCs移植后神經(jīng)修復(fù)的影響。結(jié)果顯示，MCAO損傷后，動(dòng)物發(fā)生明顯的神經(jīng)功能缺損，腦組織發(fā)生病理損傷，尼氏體明顯減少，提示腦缺血可導(dǎo)致大鼠腦組織損傷；各給藥組均能不同程度減輕腦組織損傷，且BMSCs輸注與藥物聯(lián)用組療效最佳；腦缺血后BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平升高，提示腦缺血后腦內(nèi)微環(huán)境會(huì)發(fā)生應(yīng)激變化，AST IV配伍PNS低、高劑量組以及BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合藥物低、高劑量組均能夠促進(jìn)BDNF蛋白表達(dá)，BMSCs輸注聯(lián)合藥物低、高劑量組均能夠促進(jìn)GDNF蛋白表達(dá)，但與BMSCs輸注聯(lián)合藥物相比，BMSCs輸注組效果不佳，可能與缺血微環(huán)境改變有關(guān)，提示AST Ⅳ配伍PNS主要通過促進(jìn)BDNF和GDNF蛋白表達(dá)改善缺血后微環(huán)境，從而促進(jìn)BMSCs移植后的存活和增殖。此外，BMSCs輸注聯(lián)合藥物組的免疫熒光共染結(jié)果顯示，NSE/BMSCs陽性表達(dá)升高，提示藥物可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元的分化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AST IV配伍PNS一方面可減輕腦缺血后的腦組織損傷，促進(jìn)BMSCs的存活，另一方面可通過改善腦缺血后的微環(huán)境促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元分化，發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Zhang Q, Zhao Y H, Xu Y H,. Sodium ferulate and-butylidenephthalate combined with bone marrow stromal cells (BMSCs) improve the therapeutic effects of angiogenesis and neurogenesis after rat focal cerebral ischemia [J]., 2016, 14(1): 223.

[2] 陳亞男. 紅景天苷通過ERK1/2和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向分化的研究 [D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2014.

[3] 車冠華, 戴支凱. 中藥誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究進(jìn)展 [J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué), 2015, 21(8): 14-16.

[4] 江羽, 王葉葉, 梁晨, 等. 經(jīng)木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療腦缺血再灌注損傷的研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2019, 21(4): 573-579.

[5] 黃小平, 譚華, 陳北陽, 等. 黃芪總苷和三七總皂苷配伍對(duì)腦缺血再灌注后MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(16): 2187-2191.

[6] 丁煌, 唐三, 楊筱倩, 等. 冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷對(duì)腦缺血/再灌注后血腦屏障通透性的影響 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2019, 35(11): 1516-1523.

[7] 劉曉丹, 丁煌, 鄧常清. 黃芪甲苷配伍三七總皂苷對(duì)OGD/R大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及神經(jīng)分化的影響 [J]. 中草藥, 2019, 50(23): 5795-5801.

[8] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S,. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]., 1989, 20(1): 84-91.

[9] 孔令提, 宋春麗, 石慶平. 人參皂苷對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制研究現(xiàn)狀 [J]. 中國(guó)藥房, 2019, 30(17): 2445-2448.

[10] Schmal H, Niemeyer P, Roesslein M,. Comparison of cellular functionality of human mesenchymal stromal cells and PBMC [J]., 2007, 9(1): 69-79.

[11] 劉淑艷, 劉蓮娜, 楊亦青. 間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 河北北方學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2020, 36(10): 61-65.

[12] 戚亞欽, 方燕. 間充質(zhì)干細(xì)胞及其遷移的研究進(jìn)展 [J]. 臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐, 2021, 6(6): 184-186.

[13] Huang X P, Ding H, Lu J D,. Effects of the combination of the main active components ofandon inflammation and apoptosis of nerve cell after cerebral ischemia-reperfusion [J]., 2015, 43(7): 1419-1438.

[14] Huang X P, Ding H, Yang X Q,. Synergism and mechanism of astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1against autophagic injury of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation [J]., 2017, 89: 124-134.

[15] 黃小平, 劉曉丹, 鄧常清. 黃芪和三七主要有效成分配伍對(duì)氧化損傷所致的PC12細(xì)胞凋亡及其活性氧、線粒體膜電位的影響 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào), 2012, 10(10): 1127-1134.

[16] 歐陽波, 劉曉丹, 楊筱倩, 等. 冰片配伍黃芪甲苷和三七總皂苷通過Notch信號(hào)通路對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用 [J]. 中草藥, 2020, 51(23): 5990-5997.

[17] 劉曉丹, 鄧常清. 黃芪甲苷和三七總皂苷中主要有效成分抗PC12細(xì)胞氧化損傷的配伍研究 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 32(1): 8-12.

Effect of astragaloside IV combined withsaponins on nerve repair after BMSCs transplantation in rats with cerebral ischemia

LI Yan-ling, DING Huang, FU Xin-ying, TANG San, LU Zhan-hui, YANG Fu-rong, LIU Xiao-dan, DENG Chang-qing

Hunan Provincial Key Laboratory of Cell Biology and Molecular Technology, Hunan Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To investigate the effect of astragaloside IV (AST IV) andsaponins (PNS) combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation on neural function repair in rats with cerebral ischemia.Rats were randomly divided into control group, model group, AST IV (10 mg/kg) + PNS (25 mg/kg) low dose group, AST IV (20 mg/kg) + PNS (50 mg/kg) high dose group, BMSCs infusion group, BMSCs infusion combined with AST IV (10 mg/kg) and PNS (25 mg/kg) low dose group, BMSCs infusion combined with AST IV (20 mg/kg) and PNS (50 mg/kg) high dose group. BMSCs were isolated and purified by whole bone marrow adherent method. The positive expression rates of CD29, CD90, CD34 and CD45 were detected by flow cytometry. Each drug administration group was given drugs for intervention, model of focal cerebral ischemia was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Longa method was used to determine the symptoms of neurological deficits in each group of rats; Hematoxylin-eosin (HE) staining and Nissl staining were used to determine the pathological changes in brain tissue of each group of rats; Immunofluorescence was used to detect positive expressions of neuron specific enolase (NSE) and BMSCs in hippocampus of rats in each group; Western blotting was used to determine brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) protein expressions in brain tissue of rats in each group.BMSCs were isolated and cultured successfully. The surface markers CD29, CD90, CD34 and CD45 were identified to be in accordance with the characteristics of BMSCs. Neurologic defects and pathological damage of brain tissue occurred after cerebral ischemia. Neurological deficit score and brain tissue cell damage rate in model group were significantly increased (< 0.01), and number of Nissl bodies was significantly reduced (< 0.01). Each administration group alleviated the above-mentioned pathological changes to varying degrees. Among them, the strongest effect was BMSCs infusion combined with AST Ⅳ + PNS high dose group (< 0.01), which was better than the single drug and BMSCs infusion. Neurons were damaged after cerebral ischemia in rats. After BMSCs infusion, cells could proliferate and differentiate into neurons in ischemic brain tissue. The infusion of drugs and BMSCs could enhance the proliferation and differentiation of BMSCs in brain of rats. After cerebral ischemia in rats, BDNF and GDNF protein expressions were increased, and each drug group could increase their expression to varying degrees. Among them, the strongest effect was BMSCs infusion combined with AST IV + PNS group (< 0.01), which was better than single drug and BMSCs infusion.AST Ⅳ combined with PNS can promote the survival of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation and repair the damaged neurons after cerebral ischemia. The mechanism may be related to improve the local microenvironment after cerebral ischemia and promote the survival, proliferation and differentiation of transplanted stem cells.

astragaloside IV;saponins; BMSCs; cerebral ischemia; proliferation; migration; neural differentiation

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6537 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.011

2021-04-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81904181）；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018JJ3382）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（18B236）；湖南省科技廳科技創(chuàng)新平臺(tái)與人才計(jì)劃項(xiàng)目（2017SK4005）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題（2020CX63）

李艷玲（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾哪X血管疾病的中醫(yī)藥防治。Tel: 15108955149 E-mail: 374038521@qq.com

鄧常清（1963—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事心腦血管疾病及中藥（成）分配伍研究。Tel: (0731)88458710 E-mail: dchangq@sohu.com

劉曉丹（1985—），女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樾哪X血管疾病的中醫(yī)藥防治。E-mail: 314086131@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]