鞏克 王希胤

摘? ? 要：CPP基因家族是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，具有多種生物學(xué)功能。通過利用比較基因組學(xué)的方法，對芹菜、香菜和胡蘿卜3個傘形科的物種進行分析，并將結(jié)果與萵苣、葡萄和擬南芥的CPP基因家族進行比較。結(jié)果顯示，在3個傘形科物種中共鑒定了26個基因，其中芹菜、香菜和胡蘿卜中分別有8個、12個和6個;香菜中的同源基因數(shù)量遠大于芹菜和胡蘿卜;全基因復(fù)制在CPP基因家族的擴張中發(fā)揮了重要的作用。同時，通過RNA-seq分析了不同組織中CPP基因的表達，將為傘形科中CPP和其他基因家族的比較和功能分析提供參考。

關(guān)鍵詞：傘形科;基因家族;CPP-like

文章編號： 1005-2690（2021）16-0011-03? ? ? ?中國圖書分類號： Q943.2? ? ? ?文獻標志碼： B

芹菜、香菜、胡蘿卜是傘形科的3個代表性物種，生長在世界各地，以其香味和藥用價值而聞名[1]。同時，這3種作物也具有很高的經(jīng)濟價值。

CPP轉(zhuǎn)錄因子在基因家族中是一個小型的轉(zhuǎn)錄因子家族。其成員典型特征是存在一個或兩個類似的富含Cys的結(jié)構(gòu)域，被稱為CXC結(jié)構(gòu)。從變形蟲到植物，再到哺乳動物，CXC結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出高度的保守性，CXC結(jié)構(gòu)在不同的物種中表現(xiàn)出高度的一致性[2]。CPP-like基因在生殖組織的發(fā)育和控制植物細胞的分裂中發(fā)揮著重要作用。

目前，基于多個物種基因組數(shù)據(jù)的公布，CPP轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)在擬南芥、水稻、茶樹、陸地棉和大麥等多種植物中得到鑒定和分析[3-6]，但對于傘形科物種的CPP基因家族的全面分析尚未有報道。

對傘形科的3個代表性物種的CPP基因家族進行鑒定和分析，以期闡明CPP家族進化規(guī)律，并探索芹菜和香菜不同組織中的基因表達模式，研究結(jié)果為進一步挖掘傘形科CPP轉(zhuǎn)錄因子家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1? ?結(jié)果與分析

1.1? ?基因組序列的獲取與CPP家族基因的鑒定

在葡萄、擬南芥、萵苣、芹菜、香菜和胡蘿卜中共鑒定了46個CPP基因，并根據(jù)這些在染色體上的順序重新進行了命名（見表1）。為探索CPP基因家族的進化歷史和關(guān)系，利用上述6個物種的46個CPP氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)系統(tǒng)進化樹的拓撲結(jié)構(gòu)，并參考擬南芥的分類標準，將CPP家族分為Ⅰ、Ⅱ兩個類群。Ⅰ類包含19個基因，Ⅱ類包含27個基因。

1.2? ?CPP家族基因的結(jié)構(gòu)分析和保守Motif分析

Motif分析顯示，Ⅰ類和Ⅱ類家族擁有的motif存在較大的差異，Ⅰ類家族中普遍缺少motif3、motif5和motif10，Ⅱ類家族除AgCPP4外，普遍缺乏motif6、motif7和motif8。結(jié)構(gòu)域分析顯示，大部分的CPP基因家族都擁有兩個TCR超家族結(jié)構(gòu)域，而AgCPP1、AgCPP8、CsCPP4、CsCPP11和LsCPP3只擁有1個TCR超家族結(jié)構(gòu)域，其中CsCPP4還擁有1個NT_Pol-beta-like超家族結(jié)構(gòu)域以及1個TRF4超家族結(jié)構(gòu)域。

1.3? ?CPP家族基因的同源性分析

通過對芹菜、香菜和胡蘿卜的CPP家族基因同源性分析，芹菜與香菜之間發(fā)現(xiàn)了18對直系同源基因，其中有3個基因?qū)Σ荒鼙欢ㄎ坏饺魏稳旧w上。芹菜和胡蘿卜之間發(fā)現(xiàn)12對直系同源基因。香菜和胡蘿卜之間發(fā)現(xiàn)16對直系同源基因，其中有3個基因?qū)Σ荒鼙欢ㄎ坏饺魏稳旧w上。同時，在芹菜內(nèi)部發(fā)現(xiàn)3對旁系同源基因。香菜內(nèi)部發(fā)現(xiàn)10對旁系同源基因，其中有5對基因不能被定位到染色體上。胡蘿卜內(nèi)部發(fā)現(xiàn)3對旁系同源基因。

通過計算芹菜、香菜和胡蘿卜直系同源基因?qū)Φ腒s值和Ks/Ka的值，推斷它們的分歧時間。結(jié)果顯示，直系同源基因?qū)Φ姆只瘯r間在芹菜和香菜之間為12.03～91.35百萬年，在芹菜和胡蘿卜之間為22.33～88.92百萬年，在香菜和胡蘿卜之間則為20.29～93.76百萬年。

1.4? ?CPP家族基因的擴張與全基因組復(fù)制

檢測5種基因復(fù)制的類型在芹菜、香菜和胡蘿卜中分布。結(jié)果顯示，全基因復(fù)制可能在傘形科物種CPP基因家族的擴張中起到了重要作用。在芹菜、香菜和胡蘿卜中，分別有75%、58%、100%的CPP基因是通過WGD產(chǎn)生的。除此之外，在芹菜中，有1個CPP基因?qū)儆趩慰截悘?fù)制類型，1個CPP基因?qū)儆谏⒉紡?fù)制類型。在香菜中，有3個CPP基因?qū)儆趩慰截悘?fù)制類型，2個CPP基因?qū)儆诖?lián)復(fù)制類型，見表2。

1.5? ?CPP家族基因的表達分析

通過分析CPP基因在芹菜和香菜不同組織中的表達模式，結(jié)果顯示，在芹菜的根、葉柄和葉3個組織中，AgCPP2在根部和葉中的表達水平最高，AgCPP6在葉柄中的表達水平最高，AgCPP8在3個組織的表達水平最低，不同組織之間的差異并不明顯，這表明CPP家族基因在不同組織間的表達可能沒有太大差異。在香菜根、莖、葉和花4個組織中，CsCPP4在所有組織中都有著最高的表達。而CsCPP1、CsCPP2、CsCPP3、CsCPP11、CsCPP12和CsCPP13在4個組織中的表達都非常低。CsCPP5在根部的表達水平較高，這可能暗示該基因與根部的生長發(fā)育有密切的聯(lián)系，香菜在4個組織中也沒有表現(xiàn)出明顯的差異（見圖1）。

2? ?討論

CPP轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長和發(fā)育過程，例如擬南芥AtCPP家族成員對芽、根及花序的發(fā)育發(fā)揮著重要的作用[7]。同時，CPP也受到多種非生物脅迫的調(diào)控，在不同的脅迫處理下，CCP基因的轉(zhuǎn)錄表達水平較對照處理均表現(xiàn)出顯著提高。

盡管在CPP基因家族在許多植物中被研究過，但在傘形科中還沒有相關(guān)文獻及研究。最近發(fā)布了芹菜、香菜和胡蘿卜的全基因組序列，促進了研究進程。為了解CPP基因的進化，利用芹菜、芫荽、胡蘿卜、擬南芥、萵苣和葡萄的CPP氨基酸序列構(gòu)建了一個系統(tǒng)發(fā)育樹。基因結(jié)構(gòu)和保守圖案分析顯示，同組或亞組的基因表現(xiàn)出類似的特征。香菜中的旁系同源基因?qū)Φ臄?shù)量明顯多于芹菜和胡蘿卜。此外，基于共線性分析，發(fā)現(xiàn)了WGD對芹菜科的ARF基因家族擴展有明顯影響。通過對3個芹菜科物種的ARF基因家族進行全面分析，為植物中ARF基因家族的比較和功能分析奠定了堅實的基礎(chǔ)。

3? ?材料與方法

3.1? ?基因組序列的獲取與CPP基因的鑒定

芹菜和香菜的全基因組序列從香菜數(shù)據(jù)庫中的獲取[8]，擬南芥、胡蘿卜、萵苣和葡萄的基因組序列從JGI下載。使用CPP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（PF03638）的隱馬爾可夫模型來搜索，E值設(shè)定為1e-5。

3.2? ?系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

芹菜、香菜、胡蘿卜、擬南芥、萵苣和葡萄CPP家族的氨基酸序列被用于系統(tǒng)發(fā)育分析。使用MAFFT[9]對所選物種的氨基酸序列進行比對，使用IQ-TREE[10]的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用JTT+R3模型。

3.3? ?CPP基因的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

從基因組物理位置文件中檢索每個CPP基因的染色體位置，并使用Perl腳本提取每個基因的染色體編號、起始位置和終止位置。使用TBtools繪制每個基因在染色體上的分布圖。使用CDD網(wǎng)站分析CPP家族的保守結(jié)構(gòu)域。利用MEME網(wǎng)站分析CPP家族的motif。根據(jù)基因組物理位置文件、CDD結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果和MEME預(yù)測結(jié)果，并對其進行可視化。

3.4? ?同源基因?qū)Φ蔫b定

使用OrthoMCL軟件[11]鑒定直系同源基因和旁系同源基因，e值為1e-5。使用TBtools展示CPP基因在芹菜、香菜和胡蘿卜中的關(guān)系。

3.5? ?CPP基因共線性分析和復(fù)制類型

使用MCScanX[12]進行串聯(lián)分析。氨基酸序列使用Blastp分析，e值設(shè)置為1e-5。然后通過向MCScanX提交全基因組gff文件和blast的結(jié)果文件。使用duplicate_gene_classifier子程序鑒定復(fù)制類型。

3.6? ?CPP基因的進化分析

使用MAFFT對CPP基因?qū)Φ木幋a序列（CDS）進行比對，并將比對文件轉(zhuǎn)換為axt格式。使用Ka/Ks_calculator 2.0計算同義（Ks）和非同義（Ka）替換率。分歧時間使用公式T=Ks/2r估計。R表示中性替換率（5.2×10-9每個位點每年的替代次數(shù)）。

3.7? ?CPP基因表達分析

芹菜和香菜的不同組織中CPP基因表達的RNA-seq數(shù)據(jù)來自之前的研究[13-14]。以每百萬堿基對轉(zhuǎn)錄物序列的每千字節(jié)片段（FPKM）表示的表達數(shù)據(jù)經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換后用于聚類分析。使用TBtools進行層次聚類分析。

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