張中巖， 劉詩瑩， 許金松， 盧娉婷， 劉 欣， 李煦田， 馬立軍

(華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 廣州 510006)

細(xì)胞內(nèi)pH的微弱變化可以調(diào)節(jié)諸多細(xì)胞行為，例如細(xì)胞體積的調(diào)節(jié)、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞生長、增殖和凋亡等. 同時(shí)pH的變化也是監(jiān)測癌癥的手段之一，可以通過觀察生物膜pH的變化來監(jiān)測，其pH始終低于正常細(xì)胞. pH在眾多細(xì)胞事件中具有核心作用，對炎癥、癌癥等疾病中異常細(xì)胞的生長和分裂具有重要影響[1-3]，開發(fā)能夠?qū)崟r(shí)、原位檢測pH的方法已引起越來越多的關(guān)注. pH檢測方法主要包括紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、核磁共振和電化學(xué)法等，其中，熒光光譜法由于其操作簡便、可實(shí)時(shí)和高靈敏度檢測等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注. 熒光光譜方法需要提供具有熒光性能的物質(zhì)作為檢測對象，因此pH熒光探針方法近些年得了快速發(fā)展,熒光探針方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以在不損壞細(xì)胞的情況下實(shí)時(shí)原位地監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)分布[4-10].

典型的熒光探針包括識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)，當(dāng)識(shí)別基團(tuán)接收到pH信號(hào)時(shí)，它將信號(hào)傳遞給熒光基團(tuán)，引起其熒光性能的變化. 近年來,越來越多的熒光發(fā)光基團(tuán)被應(yīng)用于熒光探針中，主要有香豆素類、熒光素類、花菁類、氟硼二吡咯染料(BODIPY)、羅丹明類以及雙光子類等物質(zhì). 它們各有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也存在一些缺陷,例如：熒光素是一種常用的pH探針,但是在細(xì)胞中容易滲出;花菁類具備很好的近紅外效應(yīng),但易被光漂白；氟硼二吡咯染料類探針的光物理性質(zhì)較為穩(wěn)定，但在溶液中的溶解性較差；雙光子pH探針特點(diǎn)鮮明,同時(shí)對實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求也明顯高于其它探針[11-14]. 本文選擇苯并呋咱作為熒光基團(tuán)，考察其衍生物作為pH熒光探針的識(shí)別性能. 苯并呋咱是重要的醫(yī)藥中間體，本文選擇其衍生物4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD-Cl)作為初始原料，它是一種含活性鹵素及芳香環(huán)硝基的熒光衍生試劑，反應(yīng)活性高、反應(yīng)速率快，能夠保證熒光探針合成過程的簡單易行[11]. 此外，本文選擇氨基、亞氨基作為識(shí)別基團(tuán)，它們具有質(zhì)子化和去質(zhì)子化能力，研究苯并呋咱胺類衍生物的pH熒光探針性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑：4-氯-7-硝基苯并呋咱、二甲基亞砜、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、二乙醇胺、乙醇胺、氨水等試劑均為分析純，市售. 溶液配制用水均為去離子水.

儀器：熒光光譜儀(FL-2500，日本日立，采用的激發(fā)波長均為465 nm)、紫外-可見分光光譜儀(UV-2700，日本島津，光路狹縫為21 nm、掃描波長范圍250～700 nm)、質(zhì)譜儀(LCQ Deca XP MAX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國熱電集團(tuán)菲尼根，陰離子測試、質(zhì)量數(shù)顯示范圍0～775)、核磁共振波譜儀(Varian 400 MHz，美國瓦里安)、pH計(jì)(雷磁PHS-3B酸度計(jì),上海精密).

1.2 探針的合成與表征

圖1為化合物NBD-N、NBD-NH和NBD-NH2的合成路線，分別稱取0.203 g(1.0 mmol )NBD-Cl溶于3個(gè)裝有二氯甲烷(20.0 mL)的圓底燒瓶中，分別向其中滴加溶有2.0 mL二乙醇胺和2.0 mL乙醇胺以及4.0 mL含氨水(體積分?jǐn)?shù)30%)的二氯甲烷溶液，在氮?dú)夥諊?、室溫下反?yīng)2 h.

圖1 化合物NBD-N、NBD-NH和NBD-NH2的合成線路圖

反應(yīng)結(jié)束后，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除溶劑，得到粗產(chǎn)物，最后用石油醚與乙酸乙酯(體積比1∶1)混合液作為洗脫劑進(jìn)行層析分離. 分離后分別得到紅色粉末狀產(chǎn)物NBD-N(0.178 g，產(chǎn)率為62.03%)、紅棕色粉末狀產(chǎn)物 NBD-NH(0.153 g，產(chǎn)率為62.17%)、綠色粉末狀產(chǎn)物 NBD-NH2(0.107 g，產(chǎn)率為60.03%).

NBD-N的核磁共振數(shù)據(jù)(400 MHz,DMSO-d6): 8.48(d,1H)、6.53(d，1H)、5.02(m，4H)、4.25(m，2H)、3.75(m，4H). NBD-NH的核磁共振數(shù)據(jù)(400 MHz,DMSO-d6):9.42(d,1H)、8.48(s,1H)、6.53(d,1H)、5.02(m,1H)、3.75(m，2H)、3.51(m，2H)、NBD-NH2的核磁共振數(shù)據(jù)(400 MHz,DMSO-d6): 9.42(d,1H)、8.48(s,1H)、6.53(d,1H)、5.02(m,1H)、3.75(m，2H)、3.51(m，2H). 上述數(shù)據(jù)中，s表示單峰，d表示二重峰，t代表三重峰，m代表多重峰，“H”前面的數(shù)字代表氫質(zhì)子的個(gè)數(shù). 對3種探針分子依次進(jìn)行質(zhì)譜分析(甲醇作為溶劑). NBD-N分子式C10H12N4O5，相對分子質(zhì)量理論值為268.08，實(shí)驗(yàn)值為267.29(去質(zhì)子化峰). NBD-NH分子式C8H8N4O4，相對分子質(zhì)量理論值為224.05，實(shí)驗(yàn)值為223.24(去質(zhì)子化峰). NBD-NH2分子式C6H4N4O3，相對分子質(zhì)量理論值為180.12，實(shí)驗(yàn)值為179.11(去質(zhì)子化峰).

1.3 溶液的配制

將3種探針分子(NBD-N、NBD-NH、NBD-NH2)分別溶于二甲基亞砜中配成儲(chǔ)備液(5.0 mmol/L).分別配備5.0 mmol/L的CuCl2、MgCl2、HgCl2、CoCl2、CaCl2、Ni(NO3)2、Cr(NO3)3、AlCl3、ZnCl2、KCl、FeCl3、AgNO3、MnCl2的水溶液. 用對應(yīng)的NaH2PO4/Na2HPO4、HAc/NaAc、H2BO3/Na2B4O7和Na2CO3/NaHCO3配成濃度為3.0 mmol/L不同pH(1.0～12.0)的緩沖溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH下探針的紫外-可見吸收光譜

不同pH條件下3種化合物的紫外-可見吸收光譜如圖2所示. 當(dāng)溶液pH接近中性時(shí)，3種化合物的紫外-可見吸收光譜均顯示出在波長350 nm和465 nm兩處苯并呋咱的特征吸收峰. 隨著溶液pH逐漸從7.0升高至12.0，NBD-N在波長350 nm處的吸收強(qiáng)度有微弱的上升，而波長465 nm處的吸收強(qiáng)度隨著pH的增加逐漸減弱并發(fā)生藍(lán)移. 這種藍(lán)移主要由于苯并呋咱的特殊結(jié)構(gòu)(苯環(huán)上1個(gè)硝基、2個(gè)碳氮雙鍵強(qiáng)拉電子基團(tuán))使得苯環(huán)上另外2個(gè)碳原子帶有部分的正電荷，當(dāng)溶液pH增加時(shí)，容易受到帶負(fù)電荷的羥基進(jìn)攻，從而降低了NBD-N分子的推-拉電子效應(yīng)，最終發(fā)生藍(lán)移. 對于NBD-NH，當(dāng)pH從7.0升至9.0，在波長476 nm處的峰值逐漸減弱，并藍(lán)移至465 nm處；當(dāng)pH從9.0升至12.0，465 nm處的峰值微弱增強(qiáng). 這可能由于NBD-NH分子中的亞胺基與羥基發(fā)生作用，形成去質(zhì)子化，從而減弱了亞胺基的供電子效應(yīng). 而當(dāng)pH從7.0升高至12.0，NBD-NH2在波長343 nm處的峰值逐漸增強(qiáng)，并紅移至357 nm，處于465 nm處峰值隨著pH的增加而增強(qiáng). 由于在堿性條件下氨基的去質(zhì)子化使氮原子的電子云密度增加，從而引起波長465 nm處吸收峰強(qiáng)度的增強(qiáng). 從以上結(jié)果可以看出，這3種化合物分子結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致了它們對pH的響應(yīng)有所不同.

圖2 3種熒光探針(10.0 μmol/L) 在不同pH水溶液中的紫外-可見吸收光譜

2.2 堿性條件下的pH識(shí)別

在不同pH的緩沖溶液(3.0 mmol/L)中，3種化合物(NBD-N、NBD-NH、NBD-NH2)的熒光發(fā)射光譜在波長550 nm處有1個(gè)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰(圖3). 當(dāng)pH由7.0升至12.0時(shí)，3種化合物的熒光光譜發(fā)生了不同程度的猝滅，NBD-N、NBD-NH、NBD-NH2的熒光強(qiáng)度猝滅率分別為76.3%、99.3%、87.5%. 根據(jù)方程[15]

圖3 3種熒光探針在不同pH緩沖溶液中的熒光發(fā)射光譜

pKa=pH+lg[(Fmax-F)/(F-Fmin)]，

可以計(jì)算NBD-N、NBD-NH、NBD-NH2的pKa分別為8.86、8.66、8.94. 結(jié)果表明：3種化合物在pH為7.0～12.0的范圍內(nèi)可以靈敏地檢測水溶液的pH，可適用于堿性環(huán)境下pH檢測的熒光探針[16]；由于3個(gè)分子結(jié)構(gòu)的類似性，使其對pH的識(shí)別響應(yīng)機(jī)理類似，而分子結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別使其表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度I的不同變化量和不同pKa. 在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)pH由7.0降至1.0時(shí)，3種探針分子(NBD-N、NBD-NH和NBD-NH2)的熒光強(qiáng)度I幾乎沒有變化，說明3種探針分子在酸性條件下對pH的變化無響應(yīng)，因此，本文不討論酸性條件的pH響應(yīng). 由圖4可知，3種探針分子在堿性條件下均具有較好的檢測能力.

圖4 3種熒光探針的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度與pH的關(guān)系

2.3 pH識(shí)別的可逆性及金屬離子干擾性

當(dāng)溶液的pH由7.0增加到12.0，NBD-N、NBD-NH和NBD-NH2的熒光光譜(圖3)顯示：3種熒光探針發(fā)生明顯的熒光識(shí)別作用，而當(dāng)分別向溶液中加入100.0 mmol/L HCl將pH調(diào)回至初始pH時(shí)，這3種熒光探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度完全恢復(fù)，說明這3熒光探針具有很好的識(shí)別可逆性，并具備可循環(huán)利用性能.

熒光探針的抗干擾能力是熒光識(shí)別的重要評價(jià)指標(biāo)，3種pH熒光探針對常見金屬離子的抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示. 在pH為7.0的條件下,分別向NBD-N、NBD-NH和NBD-NH2這3種探針的緩沖溶液中加入100.0 μmol/L Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Ag+、Zn2+、Hg2+、Mn2+、Cr3+、Al3+、Ca2+和Mg2+，發(fā)現(xiàn)3種探針的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化，說明3種探針分子具有很好的抗干擾能力，具有實(shí)際應(yīng)用潛力.

圖5 3種熒光探針在不同離子緩沖溶液中的熒光發(fā)射光譜

2.4 通過核磁共振譜對pH識(shí)別機(jī)理的研究

為了探究3種熒光探針在堿性條件下的識(shí)別機(jī)理，測試了NBD-N和NBD-NH的核磁共振圖譜，分析3種熒光探針對OH-的識(shí)別機(jī)理(圖6). 當(dāng)向探針NBD-N溶液中加入OH-后，NBD-N的4個(gè)氫質(zhì)子的化學(xué)位移變化非常明顯(圖6A)，并且每一種氫質(zhì)子均分裂成2組不同化學(xué)位移的峰：H(1)的化學(xué)位移δ=-0.11、-1.27；H(2)的化學(xué)位移δ=-0.62、-0.48；H(3)的化學(xué)位移δ=-0.37、-0.82；H(4)的化學(xué)位移δ=-0.41、-0.77. 這是由于硝基和碳氮雙鍵具有強(qiáng)拉電子效應(yīng)，使與H(1)和H(2)相連的2個(gè)C原子帶有部分的正電性. 由此提出NBD-N對OH-的識(shí)別機(jī)理(圖6B)：在堿性條件下，2個(gè)C原子與溶液中的OH-相互作用[17-18]，并產(chǎn)生2種互為同分異構(gòu)體的過渡結(jié)構(gòu)；與此同時(shí)，由于OH-帶負(fù)電荷，當(dāng)OH-與NBD-N結(jié)合時(shí)，整個(gè)NBD-N分子的電子云密度均表現(xiàn)出不同程度的增加，引起氫質(zhì)子1至4均向高場方向移動(dòng)并分裂成2個(gè)不同位移的峰，進(jìn)而改變了NBD-N的紫外吸收性能. 當(dāng)探針分子NBD-NH處于堿性條件時(shí)，氫質(zhì)子H(1)、H(2)、H(4)和H(5)發(fā)生明顯的化學(xué)位移(圖6C)，H(1)和H(2)分別向高場移動(dòng)，而H(4)和H(5)則向低場移動(dòng)，同時(shí)H(1)和H(2)分裂成2組峰. H(1)的化學(xué)位移δ=-0.83、-0.93，H(2)的化學(xué)位移δ=-0.23、-0.34，H(4)的化學(xué)位移δ=0.19，而H(5)的化學(xué)位移δ=0.22. 由此提出NBD-N對OH-的識(shí)別機(jī)理(圖6D)：一方面，由于苯環(huán)上的亞氨基能夠在堿性條件發(fā)生去質(zhì)子化，使共軛體系電子云密度增大，造成苯環(huán)上的H(1)和H(2)在高場方向有較大的化學(xué)位移；另一方面，由于亞氨基的去質(zhì)子化作用使氮原子有一對裸露的孤對電子，容易與NBD-NH中的羥基形成氫鍵，五元環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)也能促使氫鍵的形成. 因此，H(4)和H(5)在低場方向有較大的化學(xué)位移. 探針NBD-NH2與探針NBD-NH具有類似結(jié)構(gòu)且氨基更活潑、更易發(fā)生去質(zhì)子化作用，故NBD-NH2識(shí)別OH-的機(jī)理與NBD-NH的相似.

圖6 2種探針在堿性條件下的核磁共振譜及其對OH-的識(shí)別機(jī)理示意圖

3 結(jié)論

合成了3種結(jié)構(gòu)新穎的可識(shí)別堿性環(huán)境的pH熒光探針——NBD-N、NBD-NH和NBD-NH2，通過核磁共振譜與質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征. 當(dāng)水溶液的pH由7.0增大至12.0時(shí)，3種熒光探針的熒光發(fā)射峰發(fā)生不同程度的猝滅，對堿性環(huán)境表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光識(shí)別特性，與同類有機(jī)小分子熒光探針相比，3種熒光探針對堿性環(huán)境具有良好的選擇性、靈敏性、抗干擾能力以及可逆性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值. 同時(shí)，3種探針屬于苯并呋咱類pH熒光探針，這對于pH熒光探針分子的設(shè)計(jì)、苯并呋咱類熒光探針的開發(fā)具有一定的參考價(jià)值和研究意義.