張 健，喬尚怡，潘晨帆，張榕珍，郭許情，周 爽，安 健，張建軍

(北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

雞球蟲(chóng)病(Coccidiosis)是世界性的寄生蟲(chóng)原蟲(chóng)病之一[1]，自從雞球蟲(chóng)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其對(duì)禽畜牧業(yè)造成了非常嚴(yán)重的危害[2]。一旦規(guī)模較大的養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)球蟲(chóng)病，它將導(dǎo)致大量雛雞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在增加生產(chǎn)成本的同時(shí)，還影響生產(chǎn)性能[3]。作為對(duì)禽類(lèi)最有害的五大疾病之一的雞球蟲(chóng)病，需要引起人們更多的重視[4]。12至50日齡的雞為易感群體，超過(guò)50%發(fā)病率，死亡率也很高[5]。目前養(yǎng)殖業(yè)大多是集約化養(yǎng)雞，高密度的飼養(yǎng)方式使得雞球蟲(chóng)病在雞群中的傳播更為廣泛，雞球蟲(chóng)病的發(fā)病率增長(zhǎng)迅速。所以，防治好雞球蟲(chóng)病對(duì)于家禽養(yǎng)殖業(yè)非常重要。

中草藥在國(guó)際上被稱(chēng)為傳統(tǒng)植物藥，特性是天然、毒性低、無(wú)停藥期、藥物殘留量低和副作用小。研究證實(shí)，紅景天作為飼料添加劑，它可以改善動(dòng)物生長(zhǎng)或生產(chǎn)性能，提高產(chǎn)品質(zhì)量和降低死亡率、增加經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，對(duì)于紅景天應(yīng)用于預(yù)防雞球蟲(chóng)病的方面較少相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究通過(guò)測(cè)定紅景天對(duì)抗球蟲(chóng)指數(shù)ACI、細(xì)胞因子、體液免疫和腸道病理組織學(xué)變化的影響，來(lái)探明其對(duì)柔嫩艾美爾球蟲(chóng)預(yù)防效果，從而為養(yǎng)雞業(yè)提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

E.tenellaBJ4株孢子化卵囊保存于北京農(nóng)學(xué)院獸藥與疫病防控實(shí)驗(yàn)室。

紅景天全株干燥物(購(gòu)自北京博爾優(yōu)生物科技有限公司)，粉碎添加，粒度為15～30 μm；IL-2酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒和IgG的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒(購(gòu)自南京建成)。飼料為無(wú)抗球蟲(chóng)藥及其他任何抗生素的特制雛雞飼料，由華都飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 100只1日齡健康蛋雛雞，購(gòu)自房山某雞場(chǎng)。飼養(yǎng)于無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境，自由采食。在12日齡時(shí)，分為5組，每組6只，每組3個(gè)重復(fù)：陽(yáng)性對(duì)照組：攻蟲(chóng)不給藥；陰性對(duì)照組：不攻蟲(chóng)不給藥；0.5%紅景天組：飼料中混入0.5%紅景天粉末；1.0%紅景天組：飼料中混入1.0%紅景天粉末；1.5%紅景天組：飼料中混入1.5%紅景天粉末。

14日齡時(shí)，除陰性對(duì)照組不攻蟲(chóng)外，其余4組口服接種4 000個(gè)Eimeria tenella孢子化卵囊。21日齡(攻蟲(chóng)后第7天)采血后剖殺。剖殺后打開(kāi)腹腔，取出盲腸。記錄盲腸病變。盲腸處理為勻漿記錄卵囊產(chǎn)量。統(tǒng)計(jì)成活率、相對(duì)增重率、盲腸病變積分和卵囊產(chǎn)量，計(jì)算抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)；將雞盲腸組織固定于10%福爾馬林溶液中，HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察。

盲腸病變?cè)u(píng)分[6]由輕到重記為0,1,2,3,4。病變值=各組雞的平均病變?cè)u(píng)分×10。

1.2.2 血清制備及IL-2、TNF-α和IgG含量的測(cè)定 將采出的血放于10 mL離心管(不加抗凝劑)中傾斜放置，將離心管放置于37 ℃溫箱1～2 h讓血液凝固。采集的血放置于4 ℃冰箱過(guò)夜，讓血塊固縮。當(dāng)血清自然析出后，將血清吸出轉(zhuǎn)移至1 mL的離心管中，在4 ℃的離心機(jī)中800～1 000 r/min，離心10 min，棄去沉淀。將血清轉(zhuǎn)移至0.5 mL干凈的離心管中，儲(chǔ)藏在-80 ℃冰箱。IL-2、TNF-α和IgG的ELISA試劑盒測(cè)定雞血清中IL-2、TNF-α和IgG的含量。

用Excel軟件的方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析對(duì)多組數(shù)據(jù)之間的差異進(jìn)行分析比較，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天預(yù)防球蟲(chóng)效果

給藥后低劑量組采食明顯增多，高劑量組采食輕微減少，其他組飲食均正常。攻蟲(chóng)后第3天開(kāi)始，攻蟲(chóng)各組雞只都出現(xiàn)不同程度食欲減退的現(xiàn)象。21日齡剖殺進(jìn)行盲腸病變?cè)u(píng)分顯示0.5%紅景天組的雞只無(wú)盲腸病變；1.0%紅景天組和1.5%紅景天組的病變值低于陽(yáng)性対照組。各組存活率為100%，無(wú)死亡現(xiàn)象。0.5%紅景天組的抗球蟲(chóng)指數(shù)為137，大于120，為有效。1.0%紅景天組和1.5%紅景天組抗球蟲(chóng)指數(shù)低于120，但均高于陽(yáng)性對(duì)照組(表1)。

2.2 盲腸病理組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果

本試驗(yàn)中陰性對(duì)照組的盲腸病理組織學(xué)變化：黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛沒(méi)有損傷，黏膜上皮無(wú)脫落，細(xì)胞核清晰(圖1-A)。陽(yáng)性對(duì)照組的盲腸損傷最為嚴(yán)重：盲腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，腸絨毛損傷嚴(yán)重，黏膜上皮細(xì)胞脫落，且固有層紅細(xì)胞增多，腸腺增生；陽(yáng)性對(duì)照組放大400倍后觀(guān)察到盲腸黏膜固有層有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，且能觀(guān)察到較多卵囊，黃色三角所指(圖1-B和圖1-F)。0.5%紅景天組的盲腸黏膜固有層有少量紅細(xì)胞，損傷輕微，腸絨毛相對(duì)陰性對(duì)照組來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)較完整(圖1-C)。1.0%紅景天組盲腸黏膜固有層有一些紅細(xì)胞，整體結(jié)構(gòu)較完整，腸絨毛輕微增生，且沒(méi)有陰性對(duì)照組緊密，黏膜上皮細(xì)胞完整(圖1-D)。1.5%紅景天組盲腸病理組織學(xué)變化顯示，黏膜結(jié)構(gòu)模糊，有一定程度的損傷，黏膜上皮細(xì)胞體積縮小，有些破裂(圖1-E)。結(jié)果表明，陽(yáng)性組盲腸黏膜損傷情況最為嚴(yán)重，0.5%紅景天組較1.0%紅景天組、1.5%紅景天組損傷較輕，陰性對(duì)照組盲腸黏膜沒(méi)有損傷。

表1 預(yù)防球蟲(chóng)效果Tab.1 Prevention of coccidiosis effect

2.3 雞血清中IL-2、TNF-α和IgG含量

本試驗(yàn)中攻蟲(chóng)后陽(yáng)性組的雞血清中IL-2濃度比陰性組的高，差異顯著(P<0.05)。而攻蟲(chóng)給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，IL-2水平明顯降低，差異極顯著(P<0.01)。給藥攻蟲(chóng)組中0.5%紅景天組血清中IL-2水平最高，1.5%紅景天組血清中IL-2水平最低(圖2)。結(jié)果表明，在日糧中添加紅景天能顯著降低感染柔嫩艾美爾球蟲(chóng)后雛雞血清中IL-2水平。

本試驗(yàn)中攻蟲(chóng)后陽(yáng)性對(duì)照組的雞血清中TNF-α濃度比陰性對(duì)照組高，差異極顯著(P<0.01)。攻蟲(chóng)給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)比，TNF-α水平明顯降低，其中0.5%紅景天組雞血清中TNF-α相對(duì)質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。1.0%紅景天組和1.5%紅景天組雞血清中TNF-α相對(duì)質(zhì)量濃度與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。其中0.5%紅景天給藥組血清中TNF-α濃度最高，1.5%紅景天給藥組血清中TNF-α濃度最低(圖2)。結(jié)果表明，在日糧中添加一定劑量的紅景天能顯著降低感染柔嫩艾美爾球蟲(chóng)后雛雞血清中TNF-α水平。

本試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組的雞血清中IgG質(zhì)量濃度比陰性對(duì)照組低，差異顯著(P<0.05)。而攻蟲(chóng)給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，IgG水平明顯升高，差異極顯著(P<0.01)。其中低劑量0.5%紅景天給藥組雞血清中IgG含量最高(圖2)。結(jié)果表明，在日糧中添加一定比例的紅景天能顯著提高感染柔嫩艾美爾球蟲(chóng)后雛雞血清中IgG水平。結(jié)果表明，在日糧中添加一定比例的紅景天能顯著提高感染柔嫩艾美爾球蟲(chóng)后雛雞血清中IgG水平。

3 討 論

雞球蟲(chóng)病(coccidiosis)是由一種或者多種球蟲(chóng)寄生于雞的腸黏膜上皮細(xì)胞引起的一種原蟲(chóng)病，它是一種以雞的下痢、血便、生長(zhǎng)遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率高，甚至引起雞死亡為特征的寄生蟲(chóng)性疾病[7]。本研究中，陽(yáng)性對(duì)照組的相對(duì)體重增長(zhǎng)率最低，而0.5%紅景天組，1.0%紅景天組以及1.5%紅景天組的相對(duì)體重增長(zhǎng)率都較陽(yáng)性對(duì)照組高，其中0.5%紅景天組最高。推測(cè)可能是紅景天通過(guò)減輕球蟲(chóng)對(duì)腸道的損害，并改善宿主的采食量，影響了飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗(yàn)中，0.5%紅景天組采食量最高，這與李龍[8]研究結(jié)果相符，與崔曉娜[4]的研究結(jié)果不符?？赡苁羌t景天的產(chǎn)地及種類(lèi)不同而造成，也與季節(jié)及試驗(yàn)過(guò)程中雞的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

本研究中，各組存活率都為百分之百。從腸道病變和血便情況來(lái)看， 0.5%紅景天組，1.0%紅景天組以及1.5%紅景天組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，其對(duì)腸道病變和血便有不同程度的抑制效果，以0.5%紅景天組的效果最好。有研究報(bào)道，紅景天有一定的抗炎止血作用，而本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明給藥攻蟲(chóng)組中，低劑量紅景天組的雞腸道粘膜損傷最小。本試驗(yàn)在飼料中添加低劑量紅景天可以減少球蟲(chóng)對(duì)機(jī)體造成的腸道粘膜損傷。0.5%低劑量給藥組的抗球蟲(chóng)指數(shù)為137，一般來(lái)說(shuō)ACI大于120表明部分有效。表明在飼料中添加0.5%的紅景天有一定的預(yù)防雞球蟲(chóng)病的效果。中高劑量攻蟲(chóng)給藥組抗球蟲(chóng)指數(shù)不到120，但是均高于陽(yáng)性對(duì)照組，后續(xù)需進(jìn)一步研究其最佳應(yīng)用劑量和作用機(jī)理。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加紅景天, 可提高雞的免疫力。近年來(lái)人們逐漸把紅景天研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到對(duì)細(xì)胞因子的作用方面[9]。細(xì)胞因子屬于一種具有廣泛生物學(xué)活性的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子及細(xì)胞因子之間形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。白細(xì)胞介素(IL)就是重要的代表之一。其中IL-1、IL-2和IL-6在許多炎癥和免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Guan等研究經(jīng)LPS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肺損傷，通過(guò)給予紅景天苷后能顯著增強(qiáng) LPS刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的IL-2和 IL-4[10]。研究表明，紅景天刺激人外周血淋巴細(xì)胞增殖和其潛在的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的IL-2和Th2細(xì)胞的IL-4、IL-6、IL-10的水平[11]。本試驗(yàn)中，在飼料中添加紅景天可以顯著降低感染雞球蟲(chóng)后雛雞血清中的IL-2的含量。而高劑量1.5%組別的效果最好，IL-2降低的最明顯。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是機(jī)體免疫反應(yīng)中最早產(chǎn)生且非常重要的特殊炎性介質(zhì)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2等多種炎性因子，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上粘附，隨后發(fā)生炎癥反應(yīng)[12]。TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞而分泌的一種蛋白質(zhì)，具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子，與其他細(xì)胞因子共同作用參與激活免疫反應(yīng)[13]。而本試驗(yàn)中，TNF-α在低劑量組的血清中含量最高。說(shuō)明紅景天可以顯著提高感染球蟲(chóng)后雛雞血清中的TNF-α含量，從而發(fā)揮抗球蟲(chóng)作用。

血清抗體水平是從體液免疫的角度來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)，反映了機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力[14]。雞血清中的免疫球蛋白IgG發(fā)揮作用較持久，存在免疫記憶，是雞抗球蟲(chóng)感染時(shí)主要的體液免疫因子[15]。鄭明學(xué)應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析雞血液中的特異性的IgG后發(fā)現(xiàn)，雛雞感染第6天后可檢測(cè)到血清中含有IgG，并且在之后每天抗體水平逐漸上升[16]。本研究表明，添加0.5%紅景天可顯著提高肉雞血清中的IgG濃度，此結(jié)果表明添加紅景天可提高雞的體液免疫能力。總之，在飼料中添加0.5%的紅景天可以一定程度上預(yù)防雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)病。