陳 健 劉木華,2 袁海超,2 黃雙根,2 趙進(jìn)輝,2 徐 寧

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心， 南昌 330045)

0 引言

鹽酸沙拉沙星(Sarafloxacin hydrochloride，SARH)屬于喹諾酮類抗生素[1]，鹽酸強(qiáng)力霉素(Doxycycline hydrochloride，DCH)又名鹽酸多西環(huán)素，屬于四環(huán)素類抗生素[2]，二者均是廣譜抗生素，被廣泛用于雞養(yǎng)殖中[3]。在實(shí)際使用中如果不規(guī)范使用抗生素可能會(huì)導(dǎo)致雞肉中SARH和DCH殘留超標(biāo)。殘留的抗生素經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人體，會(huì)誘發(fā)致病菌產(chǎn)生耐藥性，甚至有致癌的風(fēng)險(xiǎn)[4]。為了保障消費(fèi)者的食品安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定了食品中獸藥最大殘留限量[5]，其中雞肉中SARH的最大殘留限量為10 μg/kg，DCH最大殘留限量為100 μg/kg。因此，研究雞肉中SARH和DCH殘留快速檢測技術(shù)是一項(xiàng)非常有意義的工作。

目前，液相色譜法[6-7]、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]等可用于雞肉中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素殘留的分析。這些方法的靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，但設(shè)備的成本高且使用人員需要較高的技能水平。近年來，光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于快速檢測領(lǐng)域，包括雞肉抗生素殘留的檢測[10-12]。同步熒光光譜與常規(guī)熒光光譜相比，具有譜圖簡化、選擇性提高、光散射干擾減少等特點(diǎn)[13]，更適合雞肉中抗生素殘留快速檢測分析。文獻(xiàn)[14-15]應(yīng)用同步熒光技術(shù)檢測了豬肉中頭孢菌素類抗生素的殘留，表明同步熒光技術(shù)能有效獲取肉中抗生素殘留的信息。在以上研究中，同步熒光光譜技術(shù)主要針對肉中單種抗生素殘留量進(jìn)行檢測研究。目前，尚無關(guān)于應(yīng)用同步熒光技術(shù)同時(shí)檢測雞肉中SARH和DCH殘留的研究報(bào)道。雞肉成分復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，這些物質(zhì)對SARH和DCH的熒光檢測存在一定程度的影響。因此，本文采用快速溶劑萃取法來提取雞肉中SARH和DCH的殘留，利用Mg2+與SARH和DCH生成熒光增強(qiáng)的絡(luò)合物，以采集SARH和DCH的同步熒光信號(hào)。以雞肉為載體，SARH和DCH抗生素為研究對象，建立一種雞肉中SARH和DCH殘留的同步熒光光譜快速檢測方法。

1 試驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Cary eclipse型熒光分光光度計(jì)，美國瓦里安公司；FA1004B型電子天平，上海上平儀器有限公司；全自動(dòng)RO型純水機(jī)，湖南科爾頓水務(wù)有限公司；JK-50B型超聲波清洗器，合肥金尼克機(jī)械有限公司；Vortex-5型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器有限公司；KJ-201BS型振蕩器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；JW-1024型低速離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；JJ-2B型組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇省金南儀器廠；石英比色皿，1 cm光程，宜興市晨偉玻璃儀器廠。

雞胸肉(三黃雞)，購于南昌市華潤萬家超市；SARH，純度98%以上，上海源葉生物科技有限公司；DCH，分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸鎂，乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，乙腈，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，分析純，金克隆北京生物技術(shù)有限公司；有機(jī)相針式濾器，濾膜孔徑0.45 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 樣品制備

(1)抗生素儲(chǔ)備液配制：取5.0 mg的SARH(或DCH)標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL超純水，可得到100 mg/L SARH(或DCH)儲(chǔ)備液，于4℃下儲(chǔ)存。

(2)SARH工作液配制：取0.045 mL的SARH儲(chǔ)備液，用15 mL超純水稀釋，得到0.3 mg/L SARH工作液，于4℃下儲(chǔ)存。

(3)DCH工作液配制：取0.75 mL的 DCH儲(chǔ)備液，用15 mL超純水稀釋，得到5.0 mg/L DCH工作液，于4℃下儲(chǔ)存。

(4)根據(jù)文獻(xiàn)[16]中的快速溶劑萃取法提取空白雞肉，略作修改，具體如下：稱取2.0 g均質(zhì)的雞胸肉放置于50 mL離心管中，加入10 mL提取液(乙腈與水體積比8∶2)，加入200 μL 0.1 mol/L Na2EDTA溶液，渦旋1 min，在振蕩器上振蕩15 min，于離心機(jī)4 500 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，用提取液定容至11 mL，得到空白雞肉提取液。

(5)根據(jù)文獻(xiàn)[16]中的快速溶劑萃取法提取雞肉中殘留的SARH和DCH，略作修改，具體如下：①加標(biāo)雞肉的制備：在50 mL離心管中分別加入2.2、5.5、11.0、16.5、22.0、27.5、33.0、38.5、44.0、49.5、55.0、60.5、66.0 μL的SARH儲(chǔ)備液和5.5、27.5、55.0、110.0、165.0、220.0、275.0、330.0、385.0、440.0、495.0、550.0、605.0 μL的DCH儲(chǔ)備液，兩者濃度隨機(jī)組合，用超純水定容至2 mL，加入2.0 g均質(zhì)的雞胸肉放置于50 mL離心管中，混合均勻。②雞肉中抗生素的提?。合蚣訕?biāo)雞肉中加入8 mL乙腈，以及200 μL 0.1 mol/L Na2EDTA溶液，渦旋1 min，在振蕩器上振蕩15 min，于離心機(jī)4 500 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，用提取液定容至11 mL。得到含SARH和DCH的雞肉提取液：SARH質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60 mg/L(分別對應(yīng)于雞肉中含有0.110、0.275、0.550、0.825、1.100、1.375、1.650、1.925、2.200、2.475、2.750、3.025、3.300 mg/kg SARH)，DCH質(zhì)量濃度為0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00 mg/L(分別對應(yīng)于雞肉中含有0.55、2.75、5.50、11.00、16.50、22.00、27.50、33.00、38.50、44.00、49.50、55.00、60.50 mg/kg DCH)。

1.3 三維同步熒光光譜的采集

為了采集標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的三維同步熒光光譜，分別取400 μL的SARH標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3 mg/L)、DCH標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 mg/L)、空白雞肉提取液以及含SARH和DCH的雞肉提取液(0.3 mg/L SARH，5.0 mg/L DCH)于不同的石英比色皿中，再先后加入400 μL SDS溶液(0.1 mol/L)和400 μL硫酸鎂溶液(0.1 mol/L)，采集波長差Δλ為30～260 nm(間隔10 nm)的三維同步熒光光譜。

1.4 定性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

(1)為了探究硫酸鎂溶液濃度對同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入400 μL含SARH和DCH的雞肉提取液(0.3 mg/L SARH，5.0 mg/L DCH)、400 μL SDS溶液(0.1 mol/L)和400 μL硫酸鎂溶液(0.015、0.030、0.060、0.125、0.250、0.375、0.500 mol/L)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集波長差Δλ=110 nm、12 min處的同步熒光光譜。

(2)為了探究SDS溶液濃度對同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入400 μL含SARH和DCH的雞肉提取液(0.3 mg/L SARH，5.0 mg/L DCH)、400 μL SDS溶液(0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 mol/L)和400 μL硫酸鎂溶液(0.375 mol/L)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集波長差Δλ=110 nm、12 min處的同步熒光光譜。

(3)為了探究時(shí)間對同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入400 μL含SARH和DCH的雞肉提取液(0.3 mg/L SARH，5.0 mg/L DCH)、400 μL SDS溶液(0.300 mol/L)和400 μL硫酸鎂溶液(0.375 mol/L)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集0～60 min、波長差Δλ=110 nm處的同步熒光光譜。

1.5 定量試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

向石英比色皿中依次分別加入400 μL含不同濃度SARH和DCH的雞肉提取液，400 μL SDS溶液(0.300 mol/L)，400 μL硫酸鎂溶液(0.375 mol/L)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集波長差Δλ=110 nm、12 min處的同步熒光光譜。

1.6 熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置

熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長掃描范圍為240～450 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，PMT(光電倍增管)電壓為700 V。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

在建立預(yù)測模型之前，使用The Unscrambler X 10.4軟件(挪威CAMO公司)對原始光譜進(jìn)行基線偏移，以消除原始光譜的基線漂移。其次，使用The Unscrambler X 10.4軟件對基線偏移后的光譜進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，以減少數(shù)據(jù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維同步熒光光譜

圖1給出了SARH和DCH標(biāo)準(zhǔn)溶液的三維同步熒光等高線圖。從圖1可以看出，SARH絡(luò)合物有2個(gè)強(qiáng)的熒光激發(fā)峰，位于波長差/激發(fā)波長110 nm/320 nm和150 nm/275 nm處附近。另一方面，DCH絡(luò)合物有一個(gè)較強(qiáng)的熒光激發(fā)峰，位于波長差/激發(fā)波長150 nm/368 nm處。Mg2+和喹諾酮類抗生素會(huì)形成絡(luò)合物，這類絡(luò)合物的形成可能是由于Mg2+與喹諾酮類抗生素結(jié)構(gòu)中的4位羰基氧和相鄰的羧基上的氧原子相互作用[19-20]。此外，Mg2+也能與DCH結(jié)構(gòu)中Cl2-烯醇基形成絡(luò)合物，使熒光特性較弱的DCH產(chǎn)生強(qiáng)的熒光[21]。在適當(dāng)SDS存在的條件下，熒光分子之間的碰撞猝滅會(huì)減少[22-23]。故本試驗(yàn)在Mg2+、SDS存在條件下，進(jìn)行光譜采集。

向均質(zhì)的雞胸肉中添加這兩種抗生素或不添加，通過快速溶劑萃取法得到含SARH和DCH的雞肉提取液和空白雞肉提取液，圖2給出了雞肉提取液的三維同步熒光等高線圖。從圖中可以看出，含SARH和DCH的雞肉提取液圖譜中出現(xiàn)了這兩種抗生素的熒光激發(fā)峰，但SARH絡(luò)合物在150 nm/275 nm處的熒光激發(fā)峰與雞肉提取液的熒光激發(fā)峰有較多重疊，因此本次試驗(yàn)選用波長差Δλ=110 nm，此時(shí)DCH絡(luò)合物的熒光激發(fā)峰為381 nm。

綜上所述，在雞肉提取液中SARH和DCH均可以顯現(xiàn)熒光激發(fā)峰，這說明同步熒光光譜有同時(shí)檢測雞肉中SARH和DCH殘留的潛力。

2.2 同步熒光光譜檢測條件優(yōu)化

Mg2+濃度對SARH和DCH形成絡(luò)合物有影響。由圖3a可知，硫酸鎂溶液濃度在0.015～0.375 mol/L時(shí)，隨著硫酸鎂溶液濃度的增加，SARH絡(luò)合物生成量增多，SARH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。硫酸鎂溶液濃度在0.375～0.500 mol/L時(shí)，隨著硫酸鎂溶液濃度的增加，SARH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度不變，可能是SARH和Mg2+充分絡(luò)合反應(yīng)，SARH絡(luò)合物不再生成。另一方面，硫酸鎂溶液濃度在0.015～0.060 mol/L時(shí)，隨著硫酸鎂溶液濃度的增加，DCH絡(luò)合物生成量增多，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。硫酸鎂溶液濃度在0.060～0.500 mol/L時(shí)，隨著硫酸鎂溶液濃度的增加，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度略有減弱，可能是DCH絡(luò)合物生成了沉淀[24]。綜合考慮，硫酸鎂溶液濃度在0.060～0.375 mol/L時(shí)，隨著硫酸鎂溶液濃度的增加，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度小幅度減弱，而SARH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度大幅度增加。因此，本次試驗(yàn)硫酸鎂濃度選定為0.375 mol/L。

由圖3b可知，SDS溶液濃度在0.025～0.100 mol/L時(shí)，隨著SDS溶液濃度的增加，SARH絡(luò)合物熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢；當(dāng)SDS溶液濃度大于0.100 mol/L時(shí)，SARH絡(luò)合物熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。此外，SDS溶液濃度在0.025～0.300 mol/L時(shí)，隨著SDS溶液濃度的增加，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；SDS溶液濃度大于0.300 mol/L時(shí)，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。SARH和DCH絡(luò)合物的熒光光譜增強(qiáng)，這是由于SDS達(dá)到臨界膠束濃度(8.0×10-3mol/L[25])時(shí)能形成膠束，使SARH和DCH絡(luò)合物處于有序的微環(huán)境，減小分子間的碰撞概率。換而言之，SDS膠束對SARH和DCH絡(luò)合物有保護(hù)作用，能提高它們的熒光量子產(chǎn)率[26]。隨著SDS溶液濃度的增加，膠束體系趨于穩(wěn)定，從而SARH和DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度會(huì)維持在一定的強(qiáng)度范圍內(nèi)。綜合考慮，SDS溶液濃度在0.30 mol/L時(shí)，SARH絡(luò)合物和DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度最大。因此，本次試驗(yàn)SDS溶液濃度選定為0.30 mol/L。

時(shí)間對SARH絡(luò)合物和DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度有影響。由圖3c可見，在0～60 min內(nèi)，SARH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加而減弱。另一方面，在0～60 min內(nèi)，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢。在0～12 min內(nèi)，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，12 min之后，其熒光強(qiáng)度減弱。綜合考慮，在12 min時(shí)，隨著時(shí)間增加，DCH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，而SARH絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度有所減弱，但其熒光強(qiáng)度仍遠(yuǎn)大于DCH絡(luò)合物，故選擇在12 min時(shí)進(jìn)行測定。

2.3 主成分分析

PCA的主要目的是數(shù)據(jù)降維，將原始變量進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用盡可能少的新變量來表達(dá)原始變量的數(shù)據(jù)特征[27]，消除數(shù)據(jù)冗余和噪聲。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為57.67%，是含SARH和DCH的雞肉提取液同步熒光光譜的最重要信息，第2、3、4主成分方差貢獻(xiàn)率分別為19.68%、13.58%和6.04%，前4個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為96.97%，僅3.03%信息丟失，能夠反映同步熒光光譜主要信息。

2.4 預(yù)測模型建立和預(yù)測結(jié)果分析

含SARH和DCH的雞肉提取液樣本共13個(gè)，選取7個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，以建立預(yù)測模型，剩余6個(gè)作為預(yù)測集，以分析模型預(yù)測結(jié)果，預(yù)測集的數(shù)據(jù)都落在訓(xùn)練集的范圍之內(nèi)(表1)。

表1 雞肉中SARH和DCH殘留的樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果(質(zhì)量比)Tab.1 Statistical results of samples of SARH and DCH residues in chicken mg/kg

表2 雞肉中SARH和DCH殘留的模型預(yù)測統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Statistical results of prediction model of SARH and DCH residues in chicken

綜合上述信息得到基于PLSR的預(yù)測模型綜合評(píng)價(jià)最好，本試驗(yàn)優(yōu)選PLSR算法建立雞肉中SARH和DCH殘留的預(yù)測模型，檢測雞肉中SARH和DCH殘留的檢出限分別可達(dá)0.11 mg/kg和0.55 mg/kg，并繪制了基于PLSR算法的雞肉中SARH和DCH殘留的樣本關(guān)系圖(圖4)。本方法能夠滿足雞肉中SARH和DCH殘留快速同時(shí)檢測要求，對后續(xù)研究具有一定的參考價(jià)值。

3 討論

目前，動(dòng)物源性食品中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素殘留檢測主要采用液相色譜法。如文獻(xiàn)[28-29]分別檢測了雞肉中SARH和DCH的殘留量，定量限分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg。液相色譜法具有良好的檢測精度和選擇性，但是所需的設(shè)備昂貴且體積較大，不利于雞肉中抗生素殘留快速、大批量、現(xiàn)場檢測要求。

熒光技術(shù)具有快速、大批量和可現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物源性食品抗生素殘留檢測中得到了越來越多的應(yīng)用。如文獻(xiàn)[30]建立了魚肉組織中恩諾沙星殘留的檢測方法，在0.10、0.50、1.00 mg/kg添加水平內(nèi)，回收率在79.0%～94.5%之間。文獻(xiàn)[31]建立了牛奶中鹽酸四環(huán)素殘留的檢測方法，在2.0×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6mol/L添加水平內(nèi)，回收率在99.5%～108.0%之間。文獻(xiàn)[32]建立了牛奶中四環(huán)素殘留的檢測方法，在1.0、4.0、7.0 μmol/L添加水平內(nèi)，回收率在94.75%～119.00%之間。常規(guī)熒光光譜雖然具有許多優(yōu)點(diǎn)，但在檢測雞肉中抗生素殘留量時(shí)，因其譜帶較寬，各組分的熒光光譜常發(fā)生較大范圍的重疊，造成定量分析的困難。同步熒光光譜通過同時(shí)掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長獲得，其與常規(guī)熒光光譜相比具有窄化譜帶和減少光譜重疊的優(yōu)勢。因此，同步熒光光譜更適合用于快速檢測雞肉中抗生素殘留。

4 結(jié)論

(1)分析了標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的三維同步熒光光譜，優(yōu)選出了檢測的最佳波長差Δλ為110 nm。

(2)應(yīng)用單因素試驗(yàn)分析了硫酸鎂溶液濃度、SDS溶液濃度和時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響，獲得了最佳檢測條件：硫酸鎂溶液濃度0.375 mol/L、SDS溶液濃度0.300 mol/L和采集時(shí)間12 min。